肿瘤相关Tn抗原的一步酶法高效标记

Tn抗原（GalNAc α1-Ser/Thr）是Mucin类型O-聚糖合成起始的单糖形式，在正常细胞中大多会被进一步延伸合成其它长链O-聚糖，从而表达量较低，但在很多肿瘤细胞/组织中大量表达，例如结肠癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌和胰腺癌等。多项研究证明Tn抗原的高表达与肿瘤转移或者不良预后密切相关，因此，Tn抗原是最常见的肿瘤相关抗原（tumor-associated carbohydrate antigens，TACAs）之一。

现有Tn抗原的检测技术主要依赖凝集素和抗体。广泛使用的凝集素 VVA (Vicia villosa agglutinin) 和HPA ( Helix pomatia agglutinin ) 对Tn的识别特异性均不强，不仅识别Tn糖链，还识别其它糖链结构，例如血型抗原A等，存在非特异性结合的问题。由于单糖GalNAc的免疫原性低，导致大多数Tn抗原的抗体与特异的Tn-多肽表位识别而非与Tn糖链本身结合，因此缺乏pan-Tn抗体。另外，凝集素和抗体通常对不同的Tn表位（Ser/Thr/Tyr-Tn肽表位）表现出独特的结合特异性，还需要多价相互作用才能形成较强结合，从而限制了检测的灵敏度。因此，现有Tn抗原检测仍然缺乏高特异性、高灵敏度和全方位分析的方法，方法的缺失限制了对Tn抗原的深度探究和广泛应用。因此，急需发展一种全方位地高效特异标记、富集和检测Tn抗原的方法。

近日，复旦大学卫健委糖复合物重点实验室陆豪杰/李中华团队创新性地利用一步酶法靶向标记肿瘤相关的Tn抗原，实现了对Tn抗原的高选择性和高灵敏度荧光成像、富集和位点特异性质谱鉴定等多功能检测（图1）。该工作中，研究团队首次使用人源糖基转移酶T-synthase作为酶标记方法的工具酶，并利用它对供体底物(UDP-Gal)识别的宽松特性，设计并合成了具有大分子荧光标签（Cy3）和富集标签(Biotin-S-S)的UDP-Gal类似物II和III（图2），用于Tn的一步酶法标记。

实验结果显示，一步酶法标记Tn抗原效果显著优于传统两步化学酶法标记和凝集素VVA检测方法，检测灵敏度可提高至少10-100倍。另外，一步酶法不仅可高效标记细胞裂解液、活细胞，还能在复杂的病人样本，如组织裂解液和血清中，实现高效特异性的Tn抗原检测。利用可解离的生物素标签，研究团队还成功地在HEK293F^Tn+和Jurkat细胞中鉴定出454个Tn修饰的糖蛋白和624个Tn修饰的糖基化位点，从而实现了Tn糖基化蛋白以及修饰位点的特异性鉴定，有望开发针对不同肿瘤的临床适用检测方法。

总之，该研究开发了一种灵敏、简便和高效的一步酶标记策略来检测Tn抗原。通过对糖肽、糖蛋白、细胞裂解物、活细胞、组织和血清等多种样品中Tn抗原的高效成像和检测，该策略不仅有助于研究人员对Tn抗原生物学功能的深入探究，而且有望用于癌症诊断。该一步酶法标记技术的多功能性、简单性和有效性为Tn抗原的基础研究和临床应用提供了一种有效的研究工具。

这一成果近期发表在Journal of the American Chemical Society 杂志上，复旦大学基础医学院青年副研究员李中华、博士研究生杜琪和封晓晓为论文的共同第一作者，李中华和陆豪杰教授为论文的通讯作者。

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面，或点此查看原文）：

A Versatile One-Step Enzymatic Strategy for Efficient Imaging and Mapping of Tumor-Associated Tn Antigen

Zhonghua Li,^*, # Qi Du,^# Xiaoxiao Feng,^# Xuezheng Song, Zhenggang Ren, Haojie Lu* 

J. Am. Chem. Soc., 2024, DOI: 10.1021/jacs.4c03632

陆豪杰教授简介

陆豪杰，复旦大学教授。国家杰出青年基金获得者、国家“万人计划”领军人才、科技部创新人才推进计划、上海市优秀学术带头人。现任复旦大学卫健委糖复合物重点实验室主任，中国生物化学与分子生物学会糖复合物专业委员会主任委员，中国人类蛋白质组组织专业委员会副主任委员，国际糖复合物组织（IGO）中国区代表。

长期从事蛋白质组学和糖蛋白质组学研究：以通讯作者(含共同）在J. Am. Chem. Soc., Angew. Chem., Nat. Commun.等杂志发表SCI论文近百篇；授权中国专利20项；主持过国家重点研发项目（首席）、 973课题（组长）、863面上和国家自然科学基金委重点基金等十余项国家级和省部级科研项目。

https://www.x-mol.com/university/faculty/9645 

李中华博士简介

李中华，复旦大学基础医学院生化与分子生物学系青年副研究员。2013年获得南开大学理学博士学位，2013-2015和2017-2021年间分别在浙江大学和美国埃默里大学从事博士后研究。2021年3月入职复旦大学。

主要从是糖化学生物学和糖组学研究，为功能糖组学研究提供了多项O-糖组制备和标记新技术。以一作/通讯作者（含共同）在 J. Am. Chem. Soc., Anal. Chem., J. Med. Chem.等杂志发表多篇文章，申请专利两项，获得上海市浦江人才项目、国自然青年项目和国家重点研发计划（骨干）等项目。

https://www.x-mol.com/university/faculty/382765 

科研思路分析

Q：这项研究的最初目的是什么？

A：我们研究的初衷就是想要解决目前Tn抗原检测难的问题。Tn抗原是一种已知的肿瘤相关抗原，目前已发现在多种肿瘤中高表达，但是针对其高表达的具体生物学机制如何，却知之甚少，主要就是缺乏检测的有效工具，比如高效富集Tn抗原的方法。如我们文中所述，目前的检测方法均存在一些问题，商品化的好用抗体很缺乏。因此，结合我们实验室的现有方法技术，我们就发现通过一步简单的酶促反应，T-synthase酶能将带有功能基团的Gal单糖连接到Tn抗原单糖上，实现高效的标记和富集。

Q：研究过程中遇到那些挑战？

A：本研究中最大的挑战就是如何控制整个反应体系的稳定性，例如T-synthase酶的活性和稳定性是整个方法的核心，所以前期为了获得稳定的酶活，我们试了多种不同的表达系统，并优化了纯化流程和酶反应的最适条件，最后才确定了文章中的反应体系。

Q：该研究成果可能有哪些重要的应用？哪些领域的企业或研究机构可能从该成果中获得帮助？

A：本研究中一步酶法来标记Tn的高效性和简便性可使其应用于生物医学基础研究和临床样品的快速检测中。由于本方法目前还未转化，对于大多数实验室来说可能还不能立即投入使用，我们欢迎从事Tn抗原研究的其他机构研究人员或者靶向Tn治疗的相关企业单位，如有需要可以找我们合作，我们乐于分享此技术，希望它能服务于更多的需求人群，能够推动Tn抗原的更深入研究和应用。