酶促不对称Mannich反应合成无保护的手性α,β-二氨基酸

α,β-二氨基酸不仅是许多具有生物活性的天然产物、多肽类似物和药物的关键结构基团，还是二胺类配体化合物的合成前体。尽管目前已有多种方法可用于制备α,β-二氨基酸，但这些方法往往受限于原料的预官能化处理或底物适用范围的局限。

近期，加利福尼亚大学圣芭芭拉分校的Yang Hai课题组采用酶功能定向进化策略，成功开发了一种PLP依赖型的分子间Mannichase，能够催化游离α-氨基酸与环状亚胺之间的立体选择性Mannich反应，展现出卓越的对映选择性和良好的非对映选择性。这一创新方法已被成功应用于L-tambroline的克级规模合成。此外，通过与不同亚胺生成酶的串联，研究团队构建了一个多功能生物催化级联平台，为合成结构复杂且含连续立体中心的α,β-二氨基酸提供了一种通用、简洁及原子经济的新途径。

2023年，Yang Hai课题组成功阐释了天然产物loline的pyrrolizidine骨架的生物合成机制 (下图a)，并首次发现了一种依赖于PLP的Mannich cyclase (LolT)。模型反应的结果 (下图b) 表明，LolT能够催化Δ¹-pyrroline (5) 与glycine (6) 之间的分子间Mannich反应，尽管初始反应收率仅为4-5%。通过稳态动力学分析 (下图c) 揭示，glycine的K_m值为65 mM。为了优化此反应，研究团队将glycine (6) 的起始浓度设定为100 mM。在此标准条件下 (下图b, entry 8)，LolT野生型以10%的收率成功获得了目标产物 (7和8)，并展现出优异的对映选择性和非对映选择性 (16:1 dr, ee > 99%)。

通过采用迭代饱和诱变 (ISM) 方法对LolT进行工程化，旨在提升其在分子间Mannich反应中的效率。经过对24个氨基酸位点的细致筛选，成功鉴定出5个显著增强反应活性的突变 (下图a)。其中，虽然LolT^v5突变体将反应收率提高至80%，但其非对映选择性较差（3:1 dr）。相比之下，LolT^v4不仅保持了理想的反应收率，而且表现出更优的非对映选择性（14:1 dr）。稳态动力学分析 (下图b) 表明，与野生型相比，LolT^v4在催化分子间Mannich反应的速率提高了60倍，同时glycine的K_m值也降至33 mM。基于这些优化后的数据，调整Δ¹-pyrroline (5) 与glycine (6) 的起始投料比例，并成功地将该方法应用于L-tambroline的克级规模合成。

本文首次报道了lolT^v4能够催化retro-Mannich反应，尽管其正向反应的速率约为逆反应的八百倍。为了深入探讨lolT^v4在催化分子间Mannich反应中的机理，研究团队采用了X射线晶体学、定点突变实验和分子对接模拟等多种方法，提出了lolT^v4在催化过程中可能的底物特异性、立体选择性和区域选择性的结构基础（下图c）。P427Y突变可能通过减小活性位点的体积，增强了对底物的识别能力，从而提高了反应活性；K236是一个关键的碱性残基，可能参与与PLP结合的glycine的去质子化。此外，Y125和W279的协同作用有助于环状亚胺底物的精确识别和定位。定点突变实验结果表明（下图b），W279介导的π-π相互作用对于Mannich反应的非对映选择性至关重要。

接下来，研究团队进一步拓展PLP依赖型的分子间Mannichase的底物适用范围。通过与不同亚胺生成酶的串联应用，各种5-7元环状亚胺以及刚性双环亚胺都可以作为PLP依赖型分子间Mannichase的底物,极大地拓宽了其合成应用范围。另一方面,氨基酸底物的适用范围也十分广泛, 从非极性的L-alanine (10, 14, 19) 到极性的L-serine (9, 15, 21)，以及从带负电的L-aspartic acid (11) 到带正电的L-2,3-diaminopropionic acid (12)。

综上，该研究成功地将PLP依赖型的Mannich cyclase转化为分子间Mannichase。通过这一改造，LolT^v4在催化分子间Mannich反应的速率提高了60倍，同时glycine的K_m值也降低了一倍，最终成功实现了L-tambroline的克级规模合成。这项工作为合成结构复杂且含连续立体中心的α,β-二氨基酸开辟了一条通用、简洁且符合原子经济原则的新途径。机理研究显示，W279介导的π-π相互作用在Mannich反应的非对映选择性中起着关键作用。尽管此类π-π相互作用在控制酶催化的非对映选择性中不常见，但这一发现也为未来相关酶转化的蛋白质设计与工程提供参考。

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Enzymatic Synthesis of Unprotected α,β-Diamino Acids via Direct Asymmetric Mannich Reactions

Shaonan Liu, Jinmin Gao, Yike Zou, and Yang Hai*

J. Am. Chem. Soc., 2024, DOI: 10.1021/jacs.4c05581