华中科技大学刘笔锋课题组Small：用于多重即时检测的全集成、高通量微流控分析系统

每一次疫情爆发，在资源有限的地区的预防和治疗总是捉襟见肘。关键的因素之一在于高精度、高稳定性和更全面的分析技术过渡依赖于昂贵和笨重的仪器或大型实验室及技术人员。近日，华中科技大学刘笔锋课题组联合深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司进一步提出了一种全集成的高通量微流控分析系统应用于多重即时检测，称为Dac系统。具体来说，Dac 系统只需要一个手持便携式设备，就能实现高通量的自动循环重复多步骤反应，包括按需释放多种特定溶液、高通量定量分配、计量、收集、振荡混合和废液移除。目前，Dac系统在单个芯片上可以同时对多达17个样本或目标进行高精度的自动化酶联免疫分析（ELISA）。与传统的ELISA相比，除不依赖于专业技术人员外，试剂的总体消耗量仅为原来的2%，整体检测时间缩短一半以上。在单一芯片上可以实现两个样本的至少四个感染目标的同时检测。进一步，基于条形码的多靶标结果可以快速对5个相似病例的鉴别诊断，辅助临床进行更精准的治疗。通过105例样本分析，与昂贵和庞大的临床自动化仪器相比，临床炎症分类的准确率为92.38%，定量相关系数达到R² = 0.9838，临床特异性为100%，敏感性为98.93%。因此，Dac 系统适用于建立一个经济、多功能的芯片实验室，在微流体处理和即时检测方面具有巨大的应用潜力。相关工作发表在Small 期刊上。华中科技大学生命科学与技术学院李顺基博士、章英博士为论文的共同第一作者。华中科技大学生命科学与技术学院刘笔锋教授、陈鹏副教授和李一伟教授为论文通讯作者。该工作的完成也离不开刘景轩、钱纯亘博士、冯晓均教授、杜伟教授等其他合作者的帮助。

图1. 用于 ELISA 的 Dac 系统示意图及与传统方法的比较。

研究要点：（1）提出了一种可以自动化进行多步重复混合反应、多种试剂按需释放和高通量定量分配的微流控分析系统，称为 Dac 系统。（2）只需一台简单的离心机，就能完成反应液体的按需顺序释放、分配、计量、收集、气泡振荡混合和废液移除。（3）芯片上的所有微反应单元都是独立的，可同时进行多个不同的微分析反应，输出多个样品或多个分析结果。（4）开发了三种特殊的结构设计：双虹吸阀系统、气压平衡策略和气泡振荡混合结构。

1. 微流体控制示意图

图2. Dac 系统的流体控制。(A) 用于多试剂、多样品和多目标高通量分析的 Dac 系统示意图（俯视图）。(B) 初始状态。(C) 选择性触发的密封虹吸阀。(D) 通过 3000 转/分的离心速度释放腔室内溶液。 (E) 计量腔室的液体定量、虹吸阀触发及反应腔室内溶液收集、混合和废液移除示意图（从左到右）。(F) 选择性触发另一个密封虹吸阀，实现前面所述流程的自动化循环。比例尺：黑色 3 毫米，红色 1 毫米。

2. Dac 系统的芯片结构和原理分析图

图3. (A) 芯片各层的三维结构。(B) 芯片组合的三维结构图。(C) 各功能区的三维结构图，包括密封虹吸阀（SSV）、高速定量虹吸阀（HDSV）和气压平衡（APB）结构。(D) SSV 的原理。从左至右：密封状态、低速离心或静止状态、高速离心状态、虹吸阀触发状态。P₀ 为大气压力，P₁或 P₂ 为腔室内气压，ω₀ 为阈值速度。(E) HDSV 原理：时间点 t₁ 至t₄ 分别为流体进入计量室前（t₁）、完全进入计量室（t₂）、溶液定量完成（t₃）、离心停止触发虹吸阀（t₄）。(F) APB 结构和突出结构的原理。从左到右：初始状态（废液室与大气连通，红色虚线）；逆时针低速离心 (ω₂)（溶液进入反应室，废液室与外界空气不连通，黑色虚线，阻力 (F_w) 增加）；溶液收集完成；逆时针旋转 (ω₃)；顺时针旋转 (-ω₃)，完成溶液混合反应；顺时针高速离心 (ω₁)，除去废液，回到初始状态。

3. Dac 系统的功能验证

图4. Dac 系统的功能验证。(A-C) 密封虹吸阀的验证：与封装试剂 (A)；以 3000 RPM 进行第一次离心，不进行溶液释放，使各种试剂处于准备状态 (B)；以 3000 RPM 进行第二次离心，选择性释放深红色试剂腔室溶液 (C)。(D) 验证 HDSV。(E-F) 用于收集和混合的 APB 结构验证。(G-L) HDSV 的三维仿真模拟结果：(G) 液体溶液进入计量室（3000 RPM）；(H) 过量溶液进入下游（3000 RPM）；(I) 计量完成（3000 RPM）；(J) 液体溶液进入计量室（800 RPM）；（K-L） 液体突破虹吸阀。(M) 对 85 定量的五种溶液进行均匀性分析（CV=4.98%）。(N-O）在 700 RPM 的固定离心速度下进行的混合效果测试（n=3）。(P）混合速度和角度正交组合的混合效果验证（n=3）。(Q）混合时间验证（n=3）。(R）洗涤效果（n=3）。比例尺：黑色 5 毫米，绿色 0.5 毫米，红色 2.5 毫米。

4. Dac 系统的高通量样品分析

图5. 高通量样品分析。(A) 试剂预封装。(B) 检测准备。(C) 释放封闭缓冲液（1. 计量；2. 收集；3. 混合；4. 废物清除）。(D) 释放洗涤缓冲液 1 （1. 计量；2. 收集；3. 混合；4. 废物清除） (E) 添加 17 个样品（1.计量；2.收集；3.混合；4.清除废物）。(F) 释放洗涤缓冲液 2 （1. 计量；2. 收集；3. 混合；4. 废物清除） (G) 释放的信号标记抗体（1.计量；2.收集；3.混合；4.清除废物）。(H) 释放的洗涤缓冲液 3（1.计量；2.收集；3.混合；4.清除废物）。(I）释放显色底物缓冲液（1.计量；2.收集；3.混合；4.废物清除）。(J) 图C-I 各步骤对应的反应原理图。 (K) PCT 的浓度检测范围（n=3）。(L) PCT 浓度检测的线性范围（n=3，R²=0.9867）。(M）PCT 的检测限（LOD）（n=3，P<0.01）。(N）临床样本相关性分析（n=105）。(O）Dac 系统定量测量值与临床数据的一致性分析（t 检验）（n=105）。(P-Q）临床炎症程度分类的一致性分析（n=105）。(R）ROC 曲线分析（n=105）。比例尺：黑色 5 毫米，绿色 2.5 毫米，红色 0.5 毫米。

5. Dac 系统的多靶标分析

图6. Dac 系统的多靶标检测。(A) 芯片结构示意图，包括单元结构和试剂腔室分布。(B) 多靶标分析原理和检测过程示意图。(C) 感染案例 1（n=3）。(D) 感染案例 2（n=3）。(E) 感染案例 3（n=3）。(F) 感染案例 4（个数=3）。(G）感染案例 5（n=3）。(H）60 个理论值与测试结果之间差异的 T 检验分析（P=0.8433，NS）。（I）5 个病例定性诊断的 ROC 曲线（ACU=1）。 (J) 5 个病例的热图分析。（K)）5 个病例的 PCA 聚类分析（病例 1 为 NINN；病例 2 为 BINN；病例 3 为 BIGN；病例 4 为 NIGN；病例 5 为 NNGN）。

华中科技大学刘笔锋课题组近年在微流控芯片体外快速诊断领域（免疫分析、分子检测及微生物药敏）取得了一系列进展。之前工作包括：Small Methods, 2024, 2400454.; Small 2024, 20, 2310206.；Lab Chip, 2024, 24, 3158-3168.; Biosens. Bioelectron., 2024, 255, 116240.; Anal. Chem. 2024, 96, 18, 7145–7154.等。

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面，或点此查看原文）：

Fully Integrated and High-Throughput Microfluidic System for Multiplexed Point-Of-Care Testing

Shunji Li, Ying Zhang, Jingxuan Liu, Xing Wang, Chungen Qian, Jingjing Wang, Liqiang Wu, Chenxi Dai, Huijuan Yuan, Chao Wan, Jiashuo Li, Wei Du, Xiaojun Feng, Yiwei Li, Peng Chen, Bi-Feng Liu

Small, 2024, DOI: 10.1002/smll.202401848

导师介绍

刘笔锋

https://www.x-mol.com/groups/liu_bifeng 

参考文献：

1. C. Qian, C. Wan, S. Li, Y. Xiao, H. Yuan, S. Gao, L. Wu, M. Zhou, X. Feng, Y. Li, P. Chen, and B.-F. Liu, Analytical Chemistry 2023 95 (33), 12521-12531. DOI: 10.1021/acs.analchem.3c02564.

2. H. Yuan, C. Wan, X. Wang, S. Li, H. Xie, C. Qian, W. Du, X. Feng, Y. Li, P. Chen, B.-F. Liu, Programmable Gravity Self-Driven Microfluidic Chip for Point-of-Care Multiplied Immunoassays. Small 2024, 20, 2310206. https://doi.org/10.1002/smll.202310206.