“生命以负熵为食”。虽然趋于无序才是自然的规律，生命却在分子、细胞、组织甚至整个机体水平都维持着有序的空间结构：核酸、蛋白质等生物大分子的亚细胞定位及它们之间的相互作用与其功能息息相关；细胞在空间中有序分布使得邻近细胞间可以相互通讯并协调彼此的功能。由于生物体在不同尺度下的空间排布具有重要意义，近年来化学生物学领域涌现了一系列新技术，实现了空间邻近依赖的生物大分子或细胞的标记和分析。基于这些方法及其在生物学领域的广泛应用，我们定义了邻近组（proximitome）的概念，即目标生物分子的邻近生物分子或目标细胞的邻近细胞的集合。邻近组学（proximitomics）目前主要利用可原位生成的活性化学物种进行邻近分子或细胞的空间特异性标记，其可提供分子间相互作用、生物大分子亚细胞定位及细胞间相互作用等多种尺度下的空间分布信息。这些策略所采用的活性物种具有不同的激活方式、标记范围和反应底物，因而适配于不同的应用场景。本文从活性物种的化学性质出发，对近年来邻近组学领域取得的主要进展及未来的发展趋势进行了总结与展望。

本文定义了“邻近组”的概念，并从化学活性物种的角度系统总结了近年邻近组学的发展。本文总结了目前邻近组学领域常用的活性物种，包括苯酚自由基、活化羧酸、单线态氧、卡宾（及氮宾）及亚甲基苯醌。此外，本文进一步比较了这些中间体的半衰期、标记范围、激活方式、结构多样性等性质，并分析了它们所适配的生物应用场景。

图1. 多尺度下邻近组学的研究策略示意图。

利用活性物种进行邻近组学研究可以原位标记并解析生物大分子或细胞的空间分布。在这类策略中，惰性前体（Precursor）在特定位置被光、酶或化学小分子等激活后，原位生成活性物种（Reactive species）。这些活性物种通过共价反应为邻近的生物分子或细胞带上标签。携带上标签的生物分子或细胞可被进一步分离和富集，从而实现下游分析和鉴定。由于可以迅速地被水等环境中的分子所淬灭，这些活性物种往往只能在有限地范围内扩散并实现标记（约纳米~微米尺度），达到分子水平（一般为纳米尺度）或细胞水平（一般为微米尺度）的邻近标记效果（图1）。

苯酚自由基是一类由苯酚氧化形成的活性物种，可以和蛋白质、核酸反应形成对应的加合物。苯酚自由基的半衰期一般短于1 ms，在生物体系中可由工程化的过氧化物酶在过氧化氢的存在下氧化苯酚生成。此外，小分子光敏剂或工程化的LOV结构域可以在蓝光照射下催化苯酚氧化生成自由基，从而避免使用H₂O₂造成细胞毒性。

活化羧酸是另一类常用的活性物种。相比于需要外源能量（H₂O₂或光照）才能产生的苯酚自由基，活化羧酸是细胞内源生化反应中常见的高能分子，其可以直接通过工程酶以ATP等内源分子供能催化生成生物素-AMP或短肽-AMP形成，因此具有反应条件温和、毒性更低的优势。活化羧酸反应的底物主要为蛋白质中的赖氨酸残基侧链中的伯胺基团，且目前标记对象局限于蛋白质。

单线态氧与苯酚自由基类似，可以通过小分子光敏剂或可基因编码的蛋白光敏剂在蓝光照射下激发三线态氧气生成。一旦生成，单线态氧可迅速氧化邻近的蛋白质、核酸及脂质等各类生物分子。值得一提的是，这一氧化反应只能在生物分子上引入亲电性修饰。对于蛋白与核酸，需要利用伯胺探针在这一修饰上引入富集标签或报告基团。此外，细胞中天然存在的FMN结合蛋白等内源光敏剂同样可以在蓝光激发下产生单线态氧，造成一定的标记背景。

卡宾和氮宾是两类电中性且活性极高的化学物种，一般通过双吖丙啶或芳基叠氮衍生物在紫外光激活下产生。引入小分子或金属光敏剂可以提高激活所需要的波长。卡宾和氮宾在生成后会与邻近分子通过X-H键插入等机理发生共价结合。目前还没有可基因编码的工程酶可以催化卡宾或氮宾的生成，这限制了它们在胞内邻近组学研究中的应用。

亚甲基苯醌近年来逐渐在邻近组学领域受到关注。亚甲基苯醌可由邻/对位卤甲基苯酚通过1,4或1,6自消除产生，具有强亲电性，可以和生物分子中的亲核性基团发生Michael加成反应，形成亚甲基苯醌共价加合物。和前述各类活性物种相比，亚甲基苯醌具有多种激活方式，例如化学小分子（如H₂O₂、Cu^(I)）、光催化剂及酶。此外，亚甲基苯醌的活性相对较低，因而具有更长的半衰期（在水中 > 1s）和更大的标记范围。

图2. 目前常用于邻近组学研究的活性物种

目前常用的活性物种中除亚甲基苯醌外，扩散范围均在纳米尺度，因此均可用于分子-分子相互作用的鉴定。此外，纳米尺度的标记也为亚细胞组学研究提供了十分有力的工具。在这些策略中，亚细胞区域的特异性往往通过酶的重组表达或激活剂的靶向定位等方式实现。尽管上述活性物种都可被用于亚细胞组学鉴定中，扩散半径相对更大的物种可能会引入假阳性标记。因此，在分子水平的邻近组学研究中应当采用半衰期短、扩散范围更小的活性物种。在细胞外，不同扩散性质的活性物种的标记范围区别则更加显著。卡宾、苯酚自由基及单线态氧往往只能进行接触依赖的邻近细胞标记，而亚甲基苯醌则可实现非接触依赖的邻近细胞标记，适用于不同的细胞水平邻近组学研究。

由于活性化学物种的标记行为受到物种自身生成方式、化学反应性、标记底物浓度及淬灭剂含量等多种因素的影响，在选用标记方法时应当从实际的应用场景出发加以仔细考量。例如，苯酚自由基主要受到细胞中的还原剂的淬灭，因此在胞内的标记范围一般小于20 nm，而胞外的标记范围则可达250 nm左右。卡宾类中间体则具有极高的反应活性，可以迅速被水淬灭，因此在细胞内外的标记范围基本一致。亚甲基苯醌的反应性在上述活性物种中最低，相比于分子-分子相互作用研究而言更适用于细胞水平的邻近组学研究。由于亚甲基苯醌主要被细胞中的亲核分子淬灭，亚甲基苯醌在胞外的扩散范围也显著大于胞内。尽管单线态氧和活化羧酸在邻近组学研究中已经具有广泛应用，目前还没有工作对这两类活性物种的扩散性质进行表征。在未来，对活性物种在各类体系中的标记范围进行准确检测，有助于在不同应用中挑选更合适的活性物种。此外，活性物种的激活方式与应用场景也密切相关。目前，苯酚自由基、单线态氧、及卡宾往往依赖于强氧化剂或短波长光照产生，限制了这些物种在活体中的应用。发展新的、可在更接近生理条件下激活这些活性物种的酶将为活体邻近组学研究提供更多工具。在邻近组学中应用其他活性物种并开发对应的活细胞/活体激活策略，有效拓展标记底物与范围，是此领域十分有前景的发展方向。

唐麒 博士后

北京大学化学与分子工程学院博士后。2023年于北京大学获得理学博士学位，获选2023年度博士后创新人才支持计划。目前的研究兴趣集中在糖生物学与肿瘤免疫。

陈兴 教授

北京大学化学与分子工程学院教授，生命科学联合中心、合成与功能生物分子中心研究员，主要从事化学糖生物学研究，研究内容包括：活细胞及活体中聚糖的化学标记；糖的合成、成像和组学分析；糖基化在神经系统和干细胞中的功能；糖代谢与糖基化的内在联系；基于生物正交反应的化学生物学技术等。

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