西湖大学张鑫教授&中科院大连化物所刘宇研究员&南京师范大学黄和教授团队：双功能分子探针揭示活细胞中蛋白质聚集体的不同粘度

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文章简介

环境压力和致病突变导致细胞蛋白质聚集的这一现象，与多种神经退行性疾病有关，如阿尔兹海默症、帕金森病、家族性淀粉样变性等。尽管有研究表明蛋白质聚集物的物理化学性质可能对其细胞功能和细胞毒性存在显著影响，但由于缺乏能够揭示其二者相关性的合理方法与工具，使得监测活细胞中蛋白质不同聚集物的存在及其引起的理化性质变化仍然十分困难。

蛋白质在错误折叠和聚集过程中会暴露疏水残基，导致极性降低和粘度增加。局部环境中的这种物理变化，可以通过使用对微环境变化敏感且能产生荧光信号变化的探针进行监测。可以产生荧光增溢过程的探针是检测蛋白质聚集最常用的方法和工具。然而，探针荧光强度的变化可能会由潜在的干扰因素，如荧光探针的局部浓度变化引起，而非由蛋白质构象改变引起。目前，领域内已经开发了部分比率型探针和成像方法来呈现蛋白质聚集时局部极性的变化。但相比之下，荧光寿命作为一种稳定存在的重要光物理参数，具有不受探针局部浓度变化影响等优势，因此可以作为一种可靠的参数衡量微环境蛋白质错误折叠与聚集的变化过程。利用荧光寿命的变化可以定量监测不同蛋白质聚集态的微环境粘度变化。

在该研究工作中，作者基于BODIPY（氟硼二吡咯）开发了一系列粘度敏感型荧光分子转子，此类荧光探针对局部微环境的粘度变化产生荧光强度和荧光寿命变化的双重响应（图1）。利用AggTag技术，作者成功开发了基于BODIPY的AggTag探针，并成功地在体外和活细胞内利用荧光强度和荧光寿命的变化将研究蛋白质的错误折叠与聚集过程实现可视化。

图1. BODIPY荧光团可以设计为双功能探针，通过荧光强度和寿命的变化检测蛋白质的错误折叠与聚集。

作者首先通过化学修饰手段，对BODIPY的荧光母核进行官能团的理性修饰与调控，探究了BODIPY荧光分子转子化学结构与粘度敏感性之间的构效关系，以实现对粘度敏感性的可控调节。在对所设计的荧光分子转子的光物理参数进行测试表征后，作者选择了荧光量子产率和粘度敏感性较高的酰胺取代苄基BODIPY作为分子骨架设计AggTag探针P1。该探针在8位锚定了HaloTag蛋白的生物正交反应基质（Halo-Linker），使探针P1可有效地与带有HaloTag标签的体外纯化蛋白及相应的突变体蛋白形成特异的生物正交耦合。

图2. 蛋白质的错误折叠可以诱导BODIPY-HaloTag探针P1的荧光强度和荧光寿命变化。

随后，作者利用体外纯化蛋白超氧化物歧化酶突变体SOD1(V31A)-Halo，通过多种体外测试实验，考察了探针P1光物理性质随蛋白质错误折叠产生的动态变化，发现随着蛋白质聚集程度的增加，探针的荧光强度与荧光寿命呈现线性增加，并且在体外纯化蛋白形成不可溶性聚集体时，探针的荧光强度增加了5倍。体外实验结果表明，利用荧光强度与荧光寿命的双通道信号响应，可有效实现对蛋白质不同聚集态的定量检测，同时排除了体系背景信号对检测过程的干扰（图3）。

图3.  探针的荧光寿命随着与SOD1(V31A)-Halo蛋白错折叠程度具有正相关性。

由于在活细胞内实现对蛋白质错误折叠的可视化研究对于相关疾病的诱导机制和特效药的研发具有重要意义，同时，考虑到本文开发的探针及其优异的体外检测性能，作者通过荧光共聚焦与荧光寿命成像技术（FLIM），将探针P1应用于活细胞内的蛋白质错误折叠的可视化研究。作者在HEK293T细胞内分别表达了多种亨廷顿重组蛋白质和SOD1突变体蛋白质。结合已开发的红色AggTag探针TMR，作者实现了在活细胞内对蛋白质聚集体的双通道成像（图4）。

图4. (a) 利用AggTag探针检测细胞内蛋白质聚集体的方法示意图。(b)和(c) Htt-Q110-Halo•P1和SOD1(A4V)-Halo•P1耦合物在HEK293T细胞内对可溶性蛋白质聚集体和不可溶性蛋白进行可视化成像。

同时，作者利用FLIM技术揭示了活细胞中蛋白质聚集的多步骤过程。由于细胞内不同聚集态的蛋白质具有不同的紧实度和内部微环境，因此，当细胞受到压力应激、内部蛋白形成不同聚集状态的蛋白质聚集体时，探针在活细胞内表现出不同的荧光寿命（图5）。本文报道的方法为该领域内后期定量研究细胞内蛋白质的聚集提供了新的方法手段，可以积极促进神经退行性疾病致病机制的研究和治疗方法的发展。

图5. 通过荧光寿命成像技术对活细胞内不同聚集态的蛋白质进行荧光寿命成像，定量研究活细胞内的蛋白质聚集体。

以上研究内容以“A dual-functional BODIPY-based molecular rotor probe reveals different viscosity of protein aggregates in live cells”为题发表于 Aggregate 期刊，论文第一作者为南京师范大学食品与制药工程学院的沈宝星副教授和宾夕法尼亚大学化学系的Kwan Ho Jung博士，通讯作者为西湖大学张鑫教授，中国科学院大连化学物理研究所刘宇研究员，以及南京师范大学食品与制药工程学院黄和教授。

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《聚集体（英文）》（Aggregate）创刊于2020年，是由华南理工大学、广东省大湾区华南理工大学聚集诱导发光高等研究院、Wiley 出版社三方合作创办的开放获取式英文学术期刊（双月刊）。本刊致力于报道出版“聚集”过程中的基础和应用研究的前沿科学，包括但不限于材料、化学、物理、生物以及应用工程等领域。聚集体科学研究范围广泛，单分子层次之上均可视为聚集体。特别是功能材料、化学、物理、生物技术、生命科学以及应用工程等领域的重要进展，为学术界搭建一个交流思想和意见的新平台，去分享聚集体研究的新发现和新突破，讨论聚集体研究的挑战和机遇。期刊于2023年获得首个影响因子18.8，JCI指数1.47，先后收录于DOAJ、ESCI、CAS等数据库。

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