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宋杰课题组系列文章：详细阐述环状单链DNA的蛋白表达机制及调控新思路

作者：X-MOL 2024-06-11

导读：

围绕环状单链DNA这一分子生物学新工具，宋杰课题组近期在Nature Communications 上连续发表两篇文章分别从无细胞体系（Nat. Commun., 2024, 15, 4635）和细胞及动物体内（Nat. Commun., 2023, 14, 6665）阐述环状单链DNA的蛋白表达机制及调控新思路，并详细综述了环状单链DNA的物种起源、生物效应和前沿应用（ACS Synth. Biol., 2024, 13, 1038）以及DNA作为基因治疗的潜在应用（Mol. Pharmaceutics, 2024, 21, 427）。

质粒的概念自1973年提出以来，经过50多年的发展已经成为生物医学技术领域最常用的分子工具之一。然而现在常用的质粒并不能完全满足医学合成生物学的发展需要，其中主要的原因是：现在常用的质粒都是双链环状DNA，同时因为扩增的需要存在细菌相关的复制元件，所以当质粒转染进哺乳动物细胞后会引起较强的内源性核酸免疫和细胞毒性，同时也容易造成潜在的较高的基因整合风险。因此如何挖掘和优化出更安全的分子工具以满足精准医学的发展需求是医学合成生物学的重要科学问题。

围绕以上科学问题，宋杰课题组提出基于环状单链DNA的医学合成生物学新概念。环状单链DNA（CssDNA），又可以称为单链质粒，兼具传统质粒的基因载体功能，同时又具有免疫原性弱、整合风险低以及结构可编程性，有潜力成为医学合成生物学领域重要的分子工具之一。而当前CssDNA也存在以下三个方面的挑战：1) 传统化学合成的方法难以实现长度超过500个碱基的单链合成；2) CssDNA在细胞及动物体内的免疫通路及表达机制也尚不清楚；3) 如何利用CssDNA这一新型分子工具实现疾病触发的蛋白表达和调控。

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传统环状单链是通过线性单链利用T4连接酶环化实现，而T4连接酶能够高效地环化短的线性单链（<100 nt）；T4连接酶针对长的线性单链的环化效率显著下降，另外长的线性单链（>500 nt）的合成也是当前的难点；另外，质粒作为分子工具常需要载有目的蛋白基因，整体长度一般超过500 nt。因此传统方法无法实现可承载蛋白基因的CssDNA的合成，为此宋杰课题组通过底盘菌株改造和保守序列优化发展了可放大的生物合成方法，实现可长达2万碱基且可序列定制化的CssDNA，并实现与现有质粒生产兼容的从小试到中试的高纯、高产生产工艺（图1）。

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图1. CssDNA合成的设计 (a)、表征 (b)、验证 (c) 及放大工艺 (d)。图片来源：Nat. Commun.

传统质粒的一个最常用也是最重要的功能就是作为外源蛋白表达的基因载体，CssDNA又称为单链质粒，探索其是否具有传统质粒的基因载体功能尤为重要。进一步详细验证环状单链DNA在多达30种以上的细胞内都可以作为有效的基因表达载体，实现外源功能蛋白的高效表达，并初步展示了其在动物体内的作为蛋白替代疗法的可行性（图2）。

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图2. CssDNA在各种细胞内(a)实现包括荧光蛋白(b,c)和其他功能蛋白(d)及动物体内(e)的高效表达。图片来源：Nat. Commun.

进一步为了探索CssDNA的蛋白表达机制，首先设计了一种CssDNA含有一个T7启动子区域和一个目的蛋白的编码区域，其中正义链（CssDNA(+)）包含目的蛋白表达盒的编码序列；反义链（CssDNA（-））则以相反的方向，包含目的蛋白表达盒的模板序列。不同于传统载体直接转录或翻译的表达路径，CssDNA存在自己特有的表达方式，且CssDNA(+)的表达路径不同于CssDNA(-)。对CssDNA(+)来说，它必须通过复制过程将单链DNA转化为完整的双链DNA，才能作为转录模板用于后续的蛋白表达；而对于CssDNA(-)来说，并非所有的CssDNA(-)都需要转变为完整的双链，当复制的中间产物含有以双链形式存在的T7启动子序列时，也可直接进行转录从而实现蛋白的表达。因此，当反应成分一定时，CssDNA(+)的表达水平随着CssDNA(+)载体浓度的增加呈现先升高后下降的趋势；而CssDNA(-)载体的蛋白质表达水平则作为DNA浓度的函数呈双峰分布，这是两种表达方式共存的结果（图3）。

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图3. 无细胞表达体系探究CssDNA正义链和反义链不同的表达路径。图片来源：Nat. Commun.

进一步通过真核启动子的CssDNA，探索其在哺乳动物细胞内的蛋白表达机制。基于在无细胞表达体系内发现正义和反义 Css EGFP 都会导致 EGFP 的表达，推测 Css EGFP(+)和Css EFGP(-)在表达之前都会在细胞内转化为双链 DNA。为了探究环状单链DNA的基因表达是否存在单链变双链过程，将Css EGFP(+)和Css EFGP(-)分别用lipo2000转染进MDCK细胞中，并在转染后12 h，提取对应的细胞内总DNA。设计相应的PCR引物，包括primer(+)和primer(-)，其中primer(+)与正义链Css EGFP(+)互补，primer(-)与正义链Css EGFP(-)互补。利用单引物PCR方法对未转染的Css DNA，以及转染Css DNA后对应的细胞内总DNA进行PCR扩增。结果显示，未经转染的Css EGFP(+)组与转染Css EGFP(-)的细胞总DNA组的结果一致；未经转染的Css EGFP(-)组与转染Css EGFP(+)的细胞总DNA组的结果一致。以上结果清晰地阐明了环状单链DNA的基因表达存在由单链变双链，进而再遵循中心法则最终实现蛋白表达（图4）。

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图4. 哺乳动物细胞内CssDNA的蛋白表达机制。图片来源：Nat. Commun.

环状长单链DNA不仅可以承载表达蛋白的基因序列，同时由于单链的可编程性、结构的多样性和独特的机械学性质也成为构建分子机器的优越材料。宋杰课题组进一步利用可蛋白表达的CssDNA作为基因表达载体，在无细胞体系和细胞内分别都成功实现多输入的复杂逻辑调控的蛋白表达体系（图5）。

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图5. 基于CssDNA的蛋白表达逻辑调控。图片来源：Nat. Commun.

总结与展望

宋杰课题组围绕环状单链DNA，主要开展了以下三个方面的工作：

1）合成与结构设计：通过菌株和序列优化发展了生物法实现可长达2万碱基且可序列定制化的CssDNA，进而设计并构建新型可集成化的DNA分子机器，实现微纳尺度DNA结构的精准控制；

2）调控与表达机制：系统研究了可编码蛋白的CssDNA利用DNA聚合酶复制变成双链，进而通过中心法则实现蛋白表达的机制，同时通过结构调控实现蛋白表达逻辑调控及体外的疾病检测应用；

3）递送与基因治疗：利用CssDNA优异的可编程性，可以实现从小分子到大分子的精准可控药物递送，同时可将CssDNA作为蛋白替代的长效表达载体，实现细胞因子的可控长效表达和基因治疗。

环状单链DNA的潜力远不仅如此，课题组还详细综述和展望了环状单链DNA的来源、生物学效应及应用前景（图6）。未来针对环状单链DNA的进一步研究需要融合理学的结构与修饰、工学的底盘元件挖掘与优化、生物学的合成与改造、以及医学的内源免疫和基因治疗等多学科知识和技术，将有望把环状单链DNA发展成为医学合成生物学领域重要的分子工具之一。

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图6. 系统综述CssDNA的来源、生物效应及其应用。图片来源：ACS Synth. Biol.

该系列研究工作得到了德国慕尼黑工业大学Friedrich C. Simmel教授和美国埃默里大学Yonggang Ke教授的大力支持，同时感谢国家重点研发计划、国家自然科学基金、浙江省自然科学基金、中国科学院青年交叉团队等项目资助。

相关论文：

1, Zhijin Tian, Dandan Shao, Linlin Tang, Zhen Li, Qian Chen, Yongxiu Song, Tao Li, Friedrich C. Simmel , Jie Song*, Circular single-stranded DNA as a programmable vector for gene regulation in cell-free protein expression systems, Nature Communications. 2024, 15, 4635.

2, Linlin Tang, Zhijin Tian, Jin Cheng, Yijing Zhang, Yongxiu Song, Yan Liu, Jinghao Wang, Pengfei Zhang, Yonggang Ke*, Friedrich C. Simmel*, Jie Song*. Circular single-stranded DNA as switchable vector for gene expression in mammalian cells. Nature Communications. 2023, 14, 6665.

3, Xisen Cao, Linlin Tang,* and Jie Song*. Circular Single-Stranded DNA: Discovery, Biological Effects, and Applications. ACS Synthetic Biology. 2024, 13, 1038.

4, Xiaocai Guan, Yufeng Pei,* and Jie Song*. DNA-Based Nonviral Gene Therapy Challenging but Promising. Molecular Pharmaceutics. 2024, 21, 2, 427–453.

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