江苏大学雍阳春团队Angew：活细胞点击化学实现微生物种间电子传递

不同种属细菌细胞之间的电子传递过程是近年来国际上新发现的微生物能量代谢过程，直接种间电子转移（DIET）是其中最重要的一种种间电子传递模式。DIET对于维持微生物群落功能、驱动地球元素循环和污染物迁移转化至关重要，已成为环境和地学领域研究的国际前沿。但是，DIET如何发生及其如何进行人工调控一直是困扰这一领域的、悬而未决的关键基础科学难题。

近日，江苏大学雍阳春（点击查看介绍）团队在Angewandte Chemie International Edition 杂志发表研究论文，提出了“细胞间距”是决定DIET的关键因素的科学假说和“细胞鹊桥工程”的DIET人工调控新思想。据此，研究团队以希瓦氏菌（S. oneidensis，SO）和沼泽红单胞菌（R. palustris, RP）为典型模型，通过点击化学（Click Chemistry）的细胞-细胞间距工程建立了非天然的DIET双菌体系，该策略为SO和RP搭建“鹊桥”，使“牛郎”菌（SO）终与“织女”菌（RP）相会，实现了不同种属细胞之间分子尺度的特异性直接链接。基于SO菌与RP菌分子尺度的有效链接，该研究在率先实现了希瓦氏菌细胞外膜C型细胞色素直接参与的DIET，证实了“细胞间距”是决定细胞外膜C型细胞色素DIET的关键因素的科学假说。同时，该研究还实现了SO菌与RP菌之间电子传递模式H₂介导的间接电子传递（MIET）向DIET的直接人工可控转换，证实了“细胞鹊桥工程”的可行性，为DIET过程的人工创建和调控提供了新的借鉴和思路。

图1. 利用活细胞Click在SO和RP之间建立共价连接

研究团队首先在SO与RP的细胞外表面引入炔基或叠氮修饰的单糖，并通过对应的炔基和叠氮基团荧光染料验证了细胞表面成功修饰上以上基团（图1）。接下来，研究者们使用修饰完的细胞进行Click连接，并通过肉眼直接观察到了SO与RP通过Click连接形成团聚体沉淀在培养管中。研究者们进一步发现，随着Click时间的延长，叠氮荧光染料染色产生的细胞荧光逐渐减弱，这表明修饰SO上的游离叠氮基团逐渐被修饰RP的炔基团阻断，从而证明SO与RP之间的细胞-细胞Click是成功的，并表明建立了细胞-细胞Click连接。

图2. 利用活细胞Click建立的细胞-细胞连接的表征

研究团队对Click反应后SO与RP细胞之间形成的特异性直接链接进行了荧光原位杂交（FISH）和TEM表征（图2）。在FISH分析中，简单混合（Mix）的SO和RP相互分离，几乎没有物理接触。然而，Click组出现了明显的细胞聚集，发出连接后的黄色荧光的细胞比例高达81%。此外，TEM观察证实，Click后SO和RP细胞之间实现了紧密连接。研究团队接下来利用SO的生物矿化能力进一步区分了SO和RP，可以清楚地观察到表面标记有Pd纳米颗粒的SO和RP细胞在side-by-side模式的紧密相连。

图3. 黑暗厌氧条件下SO和RP双菌体系的群落性能

接下来，研究人员根据该双菌共培养系统的设计原则，以甲烷产量作为种间电子传递（IET）效率的指标（图3）。其中额外在Mix组中加入阳离子聚合物（聚二烯丙基二甲基氯化铵（PDAD））促进细胞聚集以进一步评估细胞聚集对IET的影响（PDAD组）。在进行了Click连接后的SO和RP细胞的甲烷产量很高，达到了1.8 nmol，是Mix组的6倍。同时，底物（甲酸）的利用率也证实Click组的新陈代谢速度快于Mix组。此外，Mix组和PDAD组计算得出的甲烷产率（nmol甲烷产量/mmol甲酸消耗量）均为0.04，而Click组的甲烷产率为0.09，是Mix组和PDAD组的2.25倍。这些结果表明，Click所建立的细胞-细胞连接大大提高了SO和RP之间的电子传递效率。

图4. MIET与DIET对SO和RP共培养体系甲烷生产性能的作用

由于Click组相较于Mix组大幅提高的电子传递效率，研究人员推测双菌体系中的DIET可能被激活。接下来，研究人员对Mix与Click体系中的IET路径类型进行了研究。当阻断Mix与Click组中的H₂介导的MIET时，Mix组中的甲烷产量下降到了0.09 nmol（甲醛）与0.08 noml（SO氢化酶敲除菌），而Click组甲烷产量未受到显著影响（p>0.05）。并且通过SO黄素分泌突变株排除了其他电子穿梭体介导的MIET的可能性，证实了H₂介导的MIET是Mix组的主要IET途径，并表明其他IET途径而不是H₂介导的MIET途径在有Click组中起主导作用。接着，通过阻断Mix与Click组中的DIET电子传递链，发现Mix组中的甲烷产量未受到显著影响（p>0.05），而Click组甲烷产量下降到了0.28 noml（鱼藤酮与辣椒素），0.27 nmol（双香豆素）与0.25 noml（SO (ΔmtrC /omcA)），均被抑制了80%以上（图4）。这些结果表明细胞外膜C型细胞色素依赖的DIET是Click组中IET的主要途径。

图5. 活体细胞Click实现MIET向DIET的转换

虽然SO被认为是一种富含外膜C型细胞色素的电活性菌，但以SO为电子供体菌株的DIET之前从未被实现过。在本研究中，研究人员结合以上实验结果进一步证实了SO和RP之间由细胞外表面C型细胞色素介导的DIET是可以通过活细胞-细胞Click建立的。因此，通过Click建立共价配体后，SO和RP细胞高度接近地连接在一起，从而使SO和RP细胞之间的C型细胞色素紧密接触。在这种情况下，可能会建立一条之前从未被发现过的以SO为电子供体菌株的DIET电子传递链（电子通过SO中的MtrCAB/OmcA流向RP中潜在的C型细胞色素）。基于这一条人工建立的DIET路径实现了SO菌与RP菌之间电子传递模式H₂介导的间接电子传递（MIET）向DIET的直接转换（图5）。

总之，本研究为细胞外膜C型细胞色素介导的DIET提供了直接证据，预示自然界中可能存在更为精巧的DIET途径，为种间电子传递机理研究开拓了新的思路。此外，这种简单的细胞-细胞间距工程学思想还能为DIET工程学提供新的灵感，为DIET在生物技术、环境和健康等各个领域的应用铺平道路。

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面，或点此查看原文）：

Unnatural Direct Interspecies Electron Transfer Enabled by Living Cell-Cell Click Chemistry

Yi-Cheng Zhao, Chong Sha, Xing-Ming Zhao, Jia-Xin Du, Long Zou, Yang-Chun Yong

Angew. Chem. Int. Ed., 2024, DOI: 10.1002/anie.202402318

导师介绍

雍阳春

https://www.x-mol.com/university/faculty/173446