非天然氨基酸(ncAA)在多个领域具有举足轻重的价值。例如,用作手性配体和有机小分子催化剂,作为研究生物催化反应机理的分子探针等等。蛋白来源的天然氨基酸均为α-二级氨基酸,是目前研究最为广泛的氨基酸类型。α-三级氨基酸具有一些α-二级氨基酸无法比拟的性质,例如,蛋白质中引入α-三级氨基酸通常可以增强代谢稳定性并提高结构的刚性,从而提高蛋白的稳定性等。不对称合成α-三级氨基酸一直是合成化学界关注的重点研究方向之一。在此前的报道中,过渡金属催化结合手性配体以及仿生催化等是常用的策略。然而,这些策略均不可避免对胺基或羧基进行保护和脱保护,从而增加了合成路径的工作量和难度。
普林斯顿大学的Todd Hyster(点击查看介绍)研究团队一直致力于发展新型不对称光酶催化反应,以解决有机合成中的重要挑战。在近期的研究中,Hyster团队报道了一例光催化剂和酶的协同催化反应,利用L-苏氨酸醛缩酶(L-Threonine Aldolases, LTAs)高度对映选择性地合成了一系列α-三级氨基酸(图1C)。机理研究表明,反应涉及酶-光催化剂-底物的三元复合物。
图1C. 反应设想。图片来源:JACS
酶作为一类天然的手性催化剂,在控制立体选择性方面有着独特的优势。近年来,随着定向进化技术的迅速发展,越来越多的生物催化手性合成方法学被报道。LTAs是一种5-磷酸吡哆醛(PLP)依赖的缩合酶,该类酶天然利用甘氨酸,丙氨酸和苏氨酸作为反应底物,通过与醛类底物缩合得到β-羟基-α-氨基酸类化合物。LTAs催化活性依赖于底物和酶口袋中的赖氨酸缩合反应,经过脱质子形成关键中间体Quinonoid,这是一个富电子的稳定中间体,在天然反应中作为亲核试剂。Hyster研究团队受到烯胺和烯醇反应性的启发,提出如下设想:Quinonoid中间体可以作为一个SOMOphile,当自由基在酶口袋附近生成,如果能够迅速被稳定的Quinonoid捕捉,就能介导形成碳碳键(图1C)。由于LTAs只有一个暴露在溶剂中的前手性面,另一面被酶的氨基酸残基屏蔽,因此,由LTAs介导形成的碳碳键会获得非常高的立体选择性。
首先,作者从LTAs 家族中选择了Thermotoga maritima来源的热稳定酶TmLTA作为反应的起始催化剂,以D-丙氨酸作为Quinonoid 供体,Rose Bengal(下文简称RB)作为外源光催化剂,基于设计的机理,作者首先考察了一系列还原活性的自由基前体化合物,最终发现以烷基胺来源的Katritzky吡啶盐(下文简称KS)作为自由基前体可以产生65% L-构型的氨基酸产物,并且可以得到近乎单一的立体选择性,er>99:1 (图2)。然而在反应优化过程中,作者发现反应的产率随酶储存时间变化较大。作者猜想这可能是由TmLTA四聚体的不稳定性导致。根据先前报道的对该酶结构的研究信息得知,第86号色氨酸(W86)位于酶两个单体的界面处,将其突变为谷氨酸(E)可以通过与另一个单体的第120号精氨酸(R120)形成盐桥作用,从而增强酶的稳定性。突变体TmLTA-W86E最终以稳定可重复的90%分析收率得到产物,er > 99:1。
图2. 反应条件优化。图片来源:JACS
值得注意的是,作者发现由于Quinonoid 中间体在光照条件下不稳定,该反应需要添加10 mol% PLP。额外补充的PLP有利于反应持续高效进行,且PLP本身不催化背景反应,不影响反应的立体选择性。除了TmLTA-W86E,作者在筛选中发现Aeromonas tecta来源的TeLTA给出了与TmLTA-W86E相当的产率和选择性,并且该酶的表达量远高于TmLTA-W86E。因此,条件筛选最终得到TmLTA-W86E和TeLTA两种催化剂。
图3. α-三级氨基酸底物范围。图片来源:JACS
基于上述最优反应条件,作者考察了LTA催化ncAA合成反应的底物普适性(图3)。吡啶盐底物苯环上不同位置和不同电性的取代基 (2a-12a),例如p-OCF3、p-CF3、m-Cl、m-Me、o-F和萘环都可以很好的兼容,给出49-94%收率和单一的立体选择性(>99:1 er)。若将苯环替换为吡啶,尽管收率有所下降(13a, 18%),但是依旧获得了单一的立体选择性(>99:1 er)。除了苄基吡啶盐类底物,非苄基的吡啶盐自由基前体没有任何反应活性。经过筛选发现,当使用相应的硫鎓盐可以有效得到产物和高度的对映选择性(14a, 15a)。除了D-alanine,当使用甘氨酸作为氨基供体,相应的α-二级氨基酸也可以被高效率和高选择性地制备(图4)。更令人惊喜的是,以模板底物为例,作者使用TeLTA酶冻干粉进行大量实验进一步说明了该反应的潜在价值。2 mmol反应规模最终以46%分离收率和大于99:1 er得到高度光学纯的氨基酸产物。
图4. α-二级氨基酸底物范围。图片来源:JACS
最后,作者对反应机理做了详细的探索(图5)。Stern-Volmer实验中发现,KS和RB之间存在非线性淬灭关系,表明这是一个静态淬灭机理而非扩散控制的淬灭过程,即KS和RB催化剂在溶液中先形成了复合物,再发生相应的电子转移从而引发自由基生成。单独将酶和光催化剂RB混合并没有观察到明显的淬灭现象。作者随后进行了深入的光谱学研究。当TmLTA-W86E或者底物KS加入到RB溶液时,均会引起RB的紫外吸收发生红移。将TmLTA-W86E-RB-KS三组分混合,可以观测到一个全新的紫外吸收信号。仅混合TmLTA-W86E和底物KS,并不会得到新的吸收信号。这些实验现象表明,酶-RB-KS形成了一个三元复合物。此外,荧光各相异性实验测得RB和TmLTA-W86E之间的解离常数KD为76 μM,表明酶和外源光催化剂具有弱相互作用。作者还结合分子对接考察了RB在酶口袋或者表面的可能结合区域。结果表明,RB结合在靠近口袋的正电荷区域具有最低结合能。综合上述机理实验,作者阐明了LTA参与的光酶协同催化中自由基引发和选择性碳碳键形成过程。光催化剂RB介导了酶和底物KS之间的相互作用,在反应中形成酶-RB-KS三元复合物,由此确保自由基在靠近活性中间体Quinonoid的区域生成,从而实现高度专一的碳碳键形成。
图5. 机理研究。图片来源:JACS
综上,Hyster团队报道了L-苏氨酸醛缩酶和光催化剂Rose Bengal之间的协同催化作用,从D-丙氨酸或甘氨酸和相应的Katritzky吡啶盐或硫鎓盐出发,高效和高选择性制备了一系列非天然氨基酸。作者结合光谱学,Stern-Volmer淬灭实验,荧光各向异性实验以及分子对接揭示了独特的酶-外源光催化剂-底物三元复合物的形成。该研究不仅为α-三级氨基酸的合成提供了新策略,也为其他光酶协同催化反应的设计和机理研究奠定了基础。
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Synergistic Photoenzymatic Catalysis Enables Synthesis of a-Tertiary Amino Acids Using Threonine Aldolases
Yao Ouyang, Claire G. Page, Catherine Bilodeau, and Todd K. Hyster*
J. Am. Chem. Soc., 2024, DOI: 10.1021/jacs.4c04661
导师介绍
Todd Hyster
https://www.x-mol.com/university/faculty/379545
(供稿人:欧阳瑶)
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