用于富亮氨酸重复激酶2（LRRK2）成像的新型正电子发射断层扫描（PET）探针研发

帕金森病(PD)是一种常见的神经退行性疾病，全球60岁以上老年人患病率约为10%。尽管在临床试验中投入了大量的人力物力，但PD发病机制仍不明确，目前也没有有效的治疗措施。在过去的几十年里，多种蛋白被发现可能与PD的发病机制相关，而富亮氨酸重复激酶2（LRRK2）是其中一种具有较大潜力的靶标。事实上，LRRK2突变是目前发现的最常见的PD致病因素之一，大约有10%遗传性以及2%散发性PD病人携带LRRK2突变。尽管大量的研究证明LRRK2功能紊乱与PD密切相关，但由于其自身的复杂性，揭示LRRK2在PD发病过程中所发挥的具体的生理病理作用仍具有很大挑战。

正电子发射断层成像 (PET) 作为一种非侵入性分子成像工具，能够实时评估生物化学反应过程，有助于揭示LRRK2在PD发生与发展过程中的功能或影像，在疾病诊疗和药物研发方面中发挥着重要作用。因此亟需开发一种有效的LRRK2 PET探针来实现LRRK2在PD患者中分布和表达的体内可视化。

 近日，南京林业大学陈振教授联合美国埃默里大学Steven H. Liang教授以及日本量子科学技术研究开发机构张明荣教授在Journal of Medicinal Chemistry 上发表封面论文，对两种LRRK2 PET探针[¹¹C] 1和[¹⁸F] 2进行了系统的临床前评估。

图1. LRRK2 PET 探针

早在2023年该研究团队就联合辉瑞公司利用中枢神经系统（CNS）PET 放射性配体设计和多参数优化（MPO）选择标准，开发出了应用前景广阔的含氟 LRRK2 抑制剂先导化合物2（J. Med. Chem. 2023, 66, 1712−1724）。该先导化合物表现出良好的LRRK2效力和选择性，以及良好的PET配体属性，包括高被动膜穿透性，低P-gp相互作用，以及优异的物理化学参数。通过对啮齿类动物的LC - MS/MS“非放射性探针”研究，证实该化合物具有较高的体内结合特异性。

在本研究中，该团队旨在强调[¹¹C] 1和[¹⁸F] 2在基于啮齿动物的疾病模型中的评估。为了探究化合物1 和2与LRRK2之间的分子相互作用，作者首先进行了初步的分子对接研究。如图2所示，化合物1和2都进入了MST3的结合口袋。在化合物1和2与结合口袋之间观察到了明显的疏水作用和轻微的极性、甘氨酸和带电相互作用，表明化合物1和2中的氰基N原子与结合域的Leu102残基之间可能存在氢键。

图2. 化合物1(A)和2(B)与MST3的分子对接结构

如图3所示，放射性配体[¹¹C] 1是通过铜介导的相应芳基溴前体3与[¹¹C]氰化物的交叉偶联反应合成的，而放射性配体[¹⁸F] 2则是通过硝基前体4与[¹⁸F]氟化物的SNAr亲核取代反应制备得到的。

图3. 放射性配体[¹¹C] 1 (A) 和[¹⁸F] 2 (B)的制备

接着，作者在大鼠大脑切片中进行了体外自显影（图4和图5）来研究[¹¹C] 1和[¹⁸F] 2与LRRK2的特异性结合特点。如图4所示，在基线研究中，[¹¹C] 1在大鼠大脑各区域显示出不同的放射性水平。海马体的摄取量最高，其次是纹状体、大脑皮层、丘脑和小脑，而脑桥的摄取量最低。[¹¹C] 1的放射性分布特征与啮齿类动物中LRRK2的表达模式一致。在抑制实验中，LRRK2含量相对较高的脑区的放射性摄取减少幅度更大。相比之下，低LRRK2表达的脑区放射性摄取的降低幅度相对较低。与[¹¹C] 1类似，[¹⁸F] 2在基线条件下呈现异质性分布（海马体>大脑皮层>纹状体>丘脑>小脑>中脑），当采用化合物1作用抑制剂时，，摄取量显著降低（图5），这与NHP自显影研究的结果一致。为了进一步证明[¹⁸F] 2的结合特异性，在抑制实验中使用了结构不同的抑制剂 GNE-0877。如图5所示，在富含LRRK2的脑区放射性水平显著降低，而在LRRK2低表达的脑区则没有观察到明显的阻断结果。这些结果表明[¹¹C] 1和[¹⁸F] 2在体外与LRRK2都具有很好的特异性结合。

图4. 放射性配体[¹¹C] 1在大鼠脑切片中的体外自显影

图5. 大鼠脑切片中放射性配体[¹⁸F] 2的体外自显影

由于¹⁸F相对于¹¹C的优良性质，作者对[¹⁸F] 2进行了进一步PET研究（图6）。在基线研究中，不同脑区的VT值在2.2-2.9 mL/cm³ 之间，证实了[¹⁸F] 2具有较高的血脑屏障穿透能力。采用化合物1进行预处理导致不同脑区的放射性摄取量显著下降，这表明[¹⁸F] 2的高结合特异性。此外，在给药后30分钟和60分钟，大鼠血浆中[¹⁸F] 2的母体成分含量分别为38%和23%，证明了[¹⁸F] 2在体内具有较好的代谢稳定性。

图6. 大鼠体内 [¹⁸F] 2的 PET 图像

随后该研究团队进行了体内生物分布研究，以获得[¹⁸F] 2全身分布和清除的更深入信息。根据小鼠静脉注射[¹⁸F] 2后的体内存活时间（5、15、30和60分钟）将其分为四组。如图7所示，在脾脏、心脏、肺、胰腺、胃、小肠、肾脏和肝脏等多个外周器官中，最初出现了较高的放射性信号（> 4% ID/g），随后除胃和小肠外，几乎所有这些器官都出现了快速清除。小肠中的放射性清除缓慢，加上注射探针后60分钟小肠和肝脏中的高放射性信号，表明[¹⁸F] 2 通过肝胆和泌尿途径排出体外。本研究中未发现明显的放射性脱氟现象。

图7. 全身体外生物分布研究结果

为了进一步证实[¹⁸F] 2的临床转化价值，作者评估了[¹⁸F] 2在LRRK2 G2019S突变模型中的PET成像。值得一提的是，G2019S是所有LRRK2突变中最普遍的一种。如图8所示，[¹⁸F] 2在LRRK2 G2019S和同龄野生型（WT）小鼠大脑中均在3分钟内迅速积累，随后迅速消除。与 WT 小鼠相比，[¹⁸F] 2在G2019S小鼠大脑中的摄取量明显更高。定量分析表明，G2019S小鼠的放射性累积量提高了约22%（p ≤ 0.001）。通过Western印迹法测定G2019S和WT小鼠脑内LRRK2的表达水平，结果表明G2019S小鼠脑内LRRK2酶的含量增加了2.26倍。这些结果表明，在LRRK2 G2019S小鼠模型中，[¹⁸F] 2的摄取量升高与LRRK2酶的表达量升高是一致的。考虑到LRRK2 G2019S突变在帕金森病中的重要作用，[¹⁸F] 2可能是研究帕金森病中LRRK2变化的一种极具潜力的PET配体。

图8. 在LRRK2 G2019S小鼠模型试验

此外，大量的研究标明PD发病常常伴随着神经炎症。作为概念验证，作者利用颅内注射LPS构建神经炎症小鼠模型，并用[¹⁸F] 2进行了初步的PET成像研究。如图9所示，与注射磷酸盐缓冲液（PBS）的对照组相比，注射LPS的小鼠脑部摄取[¹⁸F] 2显著提高，定量分析结果显示放射性摄取提高了28%，这与 Western印迹的结果一致。这一初步结果为探究神经炎症啮齿动物模型中LRRK2变化的可行性奠定了基础。

图9. LPS小鼠模型试验

PF-06447475 (1) 和 PF-06455943 (2) 这两种化合物已被证明都具有良好的药理学和药代动力学性质。该团队通过铜介导的氰化反应成功合成的两种LRRK2 PET配体：[¹¹C] 1（[¹¹C]PF-06447475）和碱促进的亲核SNAr置换反应合成的[¹⁸F] 2（[¹⁸F]PF-06455943）。通过在啮齿动物身上进行自显影和PET成像研究，对[¹¹C] 1和[¹⁸F] 2进行了进一步评估，结果表明它们具有良好的脑摄取能力和特异性结合能力。特别值得注意的是，与对照组小鼠相比，[¹⁸F] 2在G2019S突变和注射LPS的小鼠模型中表现出更高的LRRK2特异性脑摄取率。综上所述，[¹⁸F] 2可能是研究帕金森病进展过程中LRRK2变化的一种新的有潜力的PET探针，值得进行更全面的临床前和临床验证。

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Preclinical Evaluation of Novel Positron Emission Tomography (PET) Probes for Imaging Leucine-Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2)

Zhen Chen, Jiahui Chen, Wakana Mori, Yongjia Yi, Jian Rong, Yinlong Li, Erick R. Calderon Leon, Tuo Shao, Zhendong Song, Tomoteru Yamasaki, Hideki Ishii, Yiding Zhang, Tomomi Kokufuta, Kuan Hu, Lin Xie, Lee Josephson, Richard Van, Yihan Shao, Stewart Factor, Ming-Rong Zhang*, and Steven H. Liang*

J. Med. Chem., 2024, 67, 2559–2569, DOI: 10.1021/acs.jmedchem.3c01687

研究团队简介

陈振教授，南京林业大学化学工程学院教授，江苏省特聘教授，博士生导师。天津大学学士、博士（导师：马军安教授），哈佛医学院联合培养博士、博士后（导师：Steven H. Liang教授），洛桑联邦理工学院博士后（导师：Nicolai Cramer教授）。2021年作为水杉学者全职加入南京林业大学化学工程学院，主要从事含氟药物研发、医学成像探针及林源天然产物合成与结构改造等领域研究，在Chem. Rev.、Chem. Soc. Rev.、Sci. Trans. Med.、J. Hepatol.、Angew. Chem. Int. Ed.、ACS Catal.、Acta Pharm. Sin. B、J. Med. Chem.、Eur. J. Med. Chem.、Org. Lett.等国际著名期刊发表论文50余篇。