滑大刘珏文&厦大王德利Angew：高亲和力和高选择性结合氯化血红素的非G-四链体适配体

与卟啉结合的适配体筛选对构建生物传感器、催化和理解生命起源具有重要意义。已报道的卟啉适配体都是富含鸟嘌呤的G-四链体（G4）DNA。这些DNA链能够与氯化血红素（Hemin）结合并产生类过氧化物酶活性。迄今为止，人们普遍认为能与卟啉结合的适配体都是G4构型，且由于堆叠作用是卟啉与G4的主要结合方式，因此这些适配体几乎无法区分不同的卟啉。而且，G4 DNA会非特异性结合其他平面分子，导致明显的干扰，阻碍了其实际应用。除了能够与G4形成堆叠的芳香环之外，卟啉还具有可能与非G4适配体发生相互作用的外围和金属配位配体。非G4适配体能够区分不同的卟啉化合物，形成更稳健的Hemin/适配体复合物，使生物传感器、催化剂和新型智能DNA纳米结构的设计更加灵活多样。

在生物学中，血红素是由Protoporphyrin IX（PPIX）螯合铁离子所得。截至目前，尚未有研究使用PPIX进行适配体筛选。在已有的氯化血红素适配体筛选中，大多都是通过固定羧基来固定氯化血红素，而此法可能掩盖一些了潜在的适配体结合位点。Capture-SELEX方法是通过将DNA文库固定，无需标记目标分子，这可能会产生新的且亲和力更好的适配体。近日，滑铁卢大学刘珏文教授和厦门大学王德利教授课题组合作，以Hemin和PPIX为目标物进行了两个独立的筛选实验，获得了K_d低至43 nM的新的卟啉适配体。

作者采用文库固定化方法筛选得到了高富集度的Hemin和PPIX的DNA序列（图1A和1B），并通过序列分析将TOP1 DNA作为候选适配体进行表征。Hemin适配体（Hem1）分析结果显示这些序列不富含鸟嘌呤，且该序列中包含两个重复的GATT(T/C)C保守区域（图1C）。如图1D所示，Hemin底部的外围配体具有镜像对称性，而顶部的外围配体具有180°的旋转对称性。在考虑到一些T和C碱基可根据序列比对互换的情况下，Hem1家族适配体中的两个结合环（尤其是Hem3）也具有旋转对称性。因此，如果Hem1家族适配体具有简单的茎环结构，适配体环可能通过其顶部部分与Hemin相互作用，如图1E所示。PPIX1适配体结构同样含有两个对称的GGGTG保守区域，且该适配体富含鸟嘌呤。

图1. Hemin（A）和PPIX（B）筛选富集的Top5序列；（C）Hem1适配体二级结构；（D）Hemin平面结构；（E）Hemin与适配体结合模型

由于卟啉具有丰富的电子吸收特征，因此作者首先使用紫外-可见光谱法评估了适配体与卟啉的结合情况。如图2所示，Hem1与Hemin结合会发生明显的Soret峰位移，而与PPIX或MPIX则没有明显的峰变化，因此Hem1适配体对Hemin的结合具有高选择性，而PPIX1适配体则能同时识别Hemin和PPIX。PPIX1和PS2.M（经典的G4 DNA）与Hem1适配体竞争性结合结果证明，Hemin/Hem1是一种更稳定的复合物，能够抵抗非特异性结合。圆二色谱实验结果证明K⁺和Hemin均不能诱导Hem1或PPIX1适配体发生形变，因此这两个适配体均是非G-四链体结构。

图2. Hem1适配体与Hemin（A）、PPIX（B）和MPIX（C）结合的紫外吸收光谱及吸收峰变化（D）；Hem1（E）和PS2.M（F）适配体与K⁺和Hemin反应后的CD光谱

由于G4 DNA与Hemin结合后具有类过氧化物酶活性，因此作者以四甲基联苯胺（TMB）为基质研究了金属离子对Hemin/ Hem1催化活性的影响。结果显示，Hem1与Hemin的结合是Mg²⁺依赖性的，而Li⁺的存在有助于催化活性的提升（图3A）。同时，作者还通过紫外-可见光谱法验证了金属离子对Hem1结合过程的影响（图3B），再次证实了Hem1适配体是非K⁺依赖的非G-四链体结构。而序列截断实验证实了保守区域所在loop环之外的碱基是具有可变性的。通过对Hem1保守区域碱基对称性研究结果发现，完全旋转对称的序列（即GATTCC）具有更高的催化活性（即Hem1-2T）和结合能力。此外，与经典的K⁺依赖的G4适配体相比，Hem1-2T具有更高的催化活性。

图3. 金属离子对Hem1催化活性（A）及结合能力（B）的影响；（C）Hem1突变体催化活性对比

通过优化Hemin溶解方法，作者成功地利用等温滴定量热法（ITC）测定了几种适配体与Hemin的解离常数。结果显示Hem1、Hem1-2T、PS2.M及PPIX1适配体与Hemin的拟合K_d分别为0.44 μM、0.043 μM、0.28 μM和0.32 μM（图4）。

图4. Hemin与Hem1（A）、Hem1-2T（B）、PS2.M（C）及PPIX1（D）适配体滴定的ITC结果

综上，作者通过Capture-SELEX方法成功获得了具有高选择性和催化活性的非G-四链体的氯化血红素结合适配体，其解离常数低至43 nM，其结合能力是经典G-四链体的5倍。同时还获得了识别PPIX的适配体。该研究是第一个对特定卟啉具有选择性结合能力的适配体的例子，并具有以下意义：1）它展示了使用适配体识别不同卟啉的可行性；2）它表明卟啉适配体可以是非G-四链体结构，而新的适配体已经证明对非特异性置换具有抗性，这是G-四链体适配体面临的一个实际问题；3）由于其封闭的茎环结构，Hem1可以轻松用于链替代反应，这使得该适配体可以补充当前基于G-四链体结构的适配体在生物传感器和纳米技术应用中的不足。

这一成果近期发表于Angewandte Chemie International Edition，厦门大学博士研究生谷利德为文章的第一作者，共同作者包括滑铁卢大学博士研究生丁玉哲、本科生周阳和厦门大学张瑶教授。王德利教授和刘珏文教授为共同通讯作者。

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面，或点此查看原文）：

Selective Hemin Binding by a Non-G-quadruplex Aptamer with Higher Affinity and Better Peroxidase-like Activity

Lide Gu, Yuzhe Ding, Yang Zhou, Yao Zhang, Deli Wang*, Juewen Liu*

Angew. Chem. Int. Ed., 2023, DOI: 10.1002/anie.202314450

研究团队介绍

谷利德，厦门大学海洋与地球学院博士研究生，导师为张瑶教授和王德利教授。主要研究方向为卟啉化合物的生物生态效应。获“近海海洋环境科学国家重点实验室（厦门大学）优秀博士生奖学金”和“国家留学基金委奖学金”，于2023年在滑铁卢大学进行博士生联合培养。

通讯作者简介

王德利，厦门大学海洋与地球学院海洋化学与地球化学系教授，博士生导师。2007年于美国纽约州立大学获博士学位，南加州大学访问学者。2008年至今在厦门大学海洋与地球学院从事教学科研工作。目前以第一作者、通讯作者及合作者身份在Sci. Adv.、J. Environ. Manage.、Front. Mar. Sci.、Mar. Chem.等期刊发表论文30余篇。主要从事研究方向包括：近岸痕量金属源汇及迁移转化过程；金属及其他营养要素的生态链地位；生物细胞内关键代谢物在海洋环境中的特殊作用及定量化研究；近岸环境金属及其他化学因素的调查及其环境污染评价与修复等。

个人主页链接：

http://coeoa.xmu.edu.cn/t/WDL/ 

刘珏文，加拿大滑铁卢大学化学系教授，博士生导师。获得加拿大化学会Fred Beamish奖，和McBryde奖章，并于2019年入选加拿大皇家学会青年院士（College Member of the Royal Society of Canada）。近年来在Chem. Rev., J. Am. Chem. Soc., Angew. Chem. Int. Ed., Anal. Chem.等期刊上发表研究论文共计400余篇，文章总引用数达42200余次，H-index为100。入选2022，2023年高被引学者。现担任Biosensors & Bioelectronics核酸部分编辑，Trends in Analytical Chemistry (TrAC)，《中国化学快报》，FACETS等杂志副主编，Journal of Analysis and Testing编委，和Langmuir，Analytical Methods, Sensors, Particle and Particle Systems Characterization编委会顾问。现主要从事核酸适配体、纳米材料和软物质的分析化学、物理化学以及表面性质的研究。

个人主页链接：

http://www.science.uwaterloo.ca/~liujw/index.html 

https://www.x-mol.com/university/faculty/75566