熵补偿拓宽DNA杂交探针检测单碱基突变的温度

单碱基突变 (Single-nucleotide variants, SNV) 是生物医学研究和临床应用的重要分子标志物。因此，开发性能优越的SNV检测技术一直是核酸生物技术的重点。截止目前，在临床中通常使用DNA杂交探针（如TaqMan探针、分子信标等）或ARMS-PCR中的特异性引物来区分突变。但是，传统杂交探针常常需要在高温下工作，且温度范围狭窄，这限制了其在临床诊断中的应用。近日，四川大学化学学院李峰教授（点击查看介绍）团队通过对DNA杂交反应进行热力学分析，发现DNA杂交探针的突变检测温度区间与杂交反应的ΔS相关，并基于此设计了熵补偿探针，成功拓宽了突变的温度检测区间。利用该探针，通过于PCR技术结合，可以实现肺癌组织样品中L858R突变的灵敏检测。

首先，李峰教授团队通过对经典杂交反应P+T→PT进行分析，得出产率与反应ΔG的关系（图1a），针对预定的突变，可以计算得到DF与反应ΔG的关系（图1b）。设定阈值为DF=3即可得出区分突变的温度区间。通过推导可以得出突变检测温度区间与杂交反应的ΔS相关（图1c）。针对线性探针和分子信标进行分析，由于这两种探针杂交反应的熵惩罚均较高，计算得出的突变检测温度区间也较窄（图1d，e）。基于这一发现，作者将固有无序区引入DNA杂交探针设计了熵补偿探针，将突变检测的温度范围从10°C扩展到30°C（图1f）。

图1. DNA杂交探针热力学分析

作者随后设计了对应的三种探针进行熔曲检测，最终估算出它们的ΔT分别为6°C、8.5°C和24.5°C（图2）。实验结果与模拟结果基本一致，表明高的熵惩罚的确为检测突变温度区间较窄的主要因素，也证实了将固有无序区域引入DNA杂交探针是扩大ΔT的有效策略。

图2. 三种探针的熔曲及对应DF

由于ΔT与ΔS直接相关，作者提出可以通过改变熵补偿探针的环的长度，将不同水平的无序性编码到Sprobe中，从而实现对∆T的微调。实验数据表明，当将环的长度从4个核苷酸增加到25个核苷酸时，∆S从-190.2 cal•mol^-1•K^-1增加到-145.4 cal•mol^-1•K^-1（图3a），相应地，∆T也从24.5°C增加到33.5°C（图3b，c）。这一发现为设计更适用于不同应用场景的DNA探针提供了更多灵活性。除了热稳定性，作者还检验了熵补偿探针在37°C下的动力学和分析性能。实验数据显示，熵补偿探针与大多数DNA杂交探针的灵敏度相近图3d，e）。

图3. 熵补偿探针突变检测温度区间的调节及其在37℃下的分析性能

作者最后将熵补偿探针应用于肺癌组织中L858R突变的检测。工作流程如下：首先从肺癌和癌旁组织中提取基因组DNA，随后使用PCR将包含L858R位点的序列进行扩增，接下来，双链PCR产物通过该研究团队之前开发的DNA均衡探针转化成单链目标DNA，随后在37°C下使用熵补偿探针进行分析（图4a）。作者首先对检出丰度进行了表征，使用A549细胞和H1975细胞的gDNA进行不同比例混合，测得突变的最低检出丰度为1%，与传统PCR法近似。接下来，作者在36对临床组织样本中使用该方法进行EGFR L858R突变的检测。结果表明，该方法在36个肿瘤组织样本中识别出了18个EGFR L858R阳性样本，并在36个非癌组织样本中识别出1个阳性样本。与标准Sanger测序方法相比，PCR-Sprobe方法的临床敏感性和特异性均为100%。此外，Sprobe还表现出与等温核酸扩增技术（如重组聚合酶扩增法）完全兼容，这意味着该技术具有在临床现场（POC）设置中的广泛应用潜力。

图4. 熵补偿探针的临床应用

这一成果近期发表在Angewandte Chemie International Edition 上，文章的第一作者是四川大学化学学院博士研究生郭晨，华西呼吸健康研究所邓慧博士和四川大学化学学院杨千帆副教授，通讯作者为四川大学化学学院李峰教授。

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面，或点此查看原文）：

Coding Intrinsic Disorder into DNA Hybridization Probes Enables Discrimination of Single Nucleotide Variants over Wide and Tunable Temperature Ranges

Chen Guo, Hui Deng, Qianfan Yang, Dan Huang, Chenlan Shen, Guan A. Wang,and Feng Li*

Angew. Chem. Int. Ed., 2023, 62, e202314386, DOI: 10.1002/anie.202314386

导师介绍

李峰

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