在电子转移途径中引入芳香性氨基酸提高细胞色素P450的催化性能

细胞色素P450酶（P450s）是一类亚铁血红素蛋白家族，可以利用分子氧羟化惰性碳原子，合成具有高价值的化合物。P450s通常具有高区域选择性和立体选择性，可进行多种反应，如羟化、环氧化、去烷基化、亚砜化和去卤化等。然而，大多数P450酶的催化效率较低，限制了其在生物催化和工业化中的应用。在P450催化循环中，电子传递过程往往是其限速步骤。优化电子传递过程可以提升其催化性能，但对P450的电子传递链的研究迄今还很有限，缺乏体系化的研究。

最近，亚琛工业大学的研究团队以细胞色素P450 BM3为模式蛋白，对其电子传递链进行了研究。研究人员通过饱和突变位于辅因子FMN和血红素之间的氨基酸，在筛选了3936个变体后，发现具有活性提升的优势变体倾向于突变成为芳香族氨基酸，如苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸等。其中，最优变体P2H02 (A399Y/Q403F) 的对底物α-异佛尔酮的催化效率 (k_cat/K_M) 为913.5 s^-1 M^-1，相比于P450 BM3野生型的催化效率 (k_cat/K_M=65.8 s^-1 M^-1)，提高了一个数量级。

通过对优势变体的计算分析，研究人员发现，在引入芳香族氨基酸后变体活性提高的分子基础有三点：（1）减少了辅因子FMN和血红素的距离，从而增加了电子超交换（superexchange）的效率；（2）芳香族氨基酸可以作为电子“垫脚石”，提升电子跃迁（hopping）效率；（3）酪氨酸和色氨酸的引入，可以将反应过程中具有破坏性的电子空穴（hole）从活性中心引导至蛋白表面，从而保护细胞色素P450免受氧化中间体（例如Compound I，H₂O₂等）的破坏。

图1. 在P450酶的电子传递途径中引入芳香族氨基酸可以显著提高其电子传递效率及催化性能。图片来源：Chin. J. Catal.

理论上讲，优化电子传递途径可以使P450酶对不同的底物具有增强的催化效果。为此，研究人员选择了具有不同尺寸和电子特性的五种底物（吲哚、苯并-1,4-二恶烷、假枯烯、十六烷基三甲基溴化铵 (CTAB) 和对二甲苯）来测试变体P2H02的催化性能。结果显示，与P450 BM3野生型相比 , 变体 P2H02 对所有五种底物都显示出明显的改善，其催化性能（k_cat/K_M）提升了从 3.8 倍到 7.1 倍不等。为了验证工程化策略的普适性，研究人员还对源自Rhodococcus ruber 的CYP116B3的进行了理性设计。与P450 BM3 的 FMN-FAD 电子传递系统不同，CYP116B3 利用 FMN- Fe2S2 系统将电子转移到血红素铁。结果表明，引入芳香族氨基酸的策略对CYP116B3同样有效，变体CYP116B3-Q379Y的催化效率比CYP116B3野生型提升了9.16 倍。

图2. 由色氨酸和酪氨酸形成的拯救途径链（rescue pathway）可以保护细胞色素P450的活性中心不受电子空穴的破坏。图片来源：Chin. J. Catal.

总之，这项研究第一次全面探究了细胞色素P450中电子传递的机制，并提出了一种全新的工程化电子传递链改造策略。电子传递链的改造为蛋白工程师们提供了一种强大的工具来设计高效的细胞色素P450酶，也为类似机制的其他蛋白质的研究提供了指导。

这一成果近期发表在Chinese Journal of Catalysis 上。文章第一作者是德国亚琛工业大学在读博士孟帅奇、北京化工大学硕士研究生李忠玉以及亚琛工业大学生物技术所项目负责人季宇博士。季宇博士、Mehdi D. Davari博士、Ulrich Schwaneberg教授为论文的共同通讯作者。

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面，或点此查看原文）：

Introduction of aromatic amino acids in electron transfer pathways yielded improved catalytic performance of cytochrome P450s

Shuaiqi Meng, Zhongyu Li, Yu Ji, Anna Joelle Ruff, Luo Liu, Mehdi D. Davari, Ulrich Schwaneberg

Chin. J. Catal., 2023, 49, 81-90, DOI: 10.1016/S1872-2067(23)64445-6