“一石二鸟”策略助力核心岩藻糖基化和O-GlcNAc糖基化位点的精准解析

近年来，糖基化在肿瘤和免疫治疗等领域引起了研究者越来越多的关注。糖类除了作为能量物质，还参与细胞增殖、代谢和免疫反应等重要的生物过程。蛋白糖基化是一种重要的蛋白翻译后修饰。根据糖与蛋白连接方式的不同，糖基化主要被分为N糖基化、O糖基化和C糖基化等，核心岩藻糖基化是一种结构特异性的N糖基化修饰，由岩藻糖基转移酶FUT8催化形成。研究表明，核心岩藻糖基化在多种肿瘤组织中高表达，核心岩藻糖基化的甲胎蛋白（AFP-L3）是肝癌临床诊断的生物标志物。O-GlcNAc糖基化是一种研究广泛的O糖基化，O-GlcNAc糖基转移酶（OGT）和O-GlcNAc糖苷水解酶（OGA）调控其在体内的动态平衡。研究表明，O-GlcNAc糖基化表达水平异常与细胞的生物功能改变密切相关。因此，系统解析核心岩藻糖基化和O-GlcNAc糖基化修饰位点和关键糖蛋白的发现，有助于深入研究蛋白糖基化在调控细胞生命活动过程中的作用机制。由于，糖基化修饰的丰度低，在进行糖蛋白组学研究时常常需要富集过程以提高质谱的检查效率。近年，化学酶法策略在蛋白糖基化领域的研究已有诸多报道，而化学酶法策略的高度选择性有利于目标糖基化修饰的富集和后续的质谱检测。

近日，中国科学院上海药物研究所的文留青研究员（点击查看介绍）团队和周虎研究员（点击查看介绍）团队利用特异性识别核心岩藻糖基化和O-GlcNAc糖基化的酶、叠氮化探针分子和功能化温度敏感的富集材料，实现了两种糖基化位点的同步精准解析。不同细菌源的野生型糖苷内切酶能够选择性识别并水解不同结构的N糖结构，而合适的糖苷内切酶突变体具有糖合成酶活性。研究者筛选了多种酶的活性，发现EndoCC-N180H能够选择性地标记O-GlcNAc糖肽，催化活性优于已经报道的EndoM突变体，而EndoF3-D165A能够选择性地标记核心岩藻糖肽。但接下来的实验发现，使用传统的生物素化探针分子无法实现两种糖基化修饰的有效富集（非特异性标记信号和探针分子除去困难）。为了解决上述问题，研究者筛选了大量的固相合成材料，然而这些材料均不能被糖苷内切酶有效识别。最后研究者发现一种温敏材料（聚(N-异丙基丙烯酰胺)聚合物，PNIPAM polymer）。在常温下，这种温敏材料溶解在水中，能够很好地被糖苷内切酶识别。实验发现，利用这种温敏材料能够实现目标糖肽的富集和可逆无痕释放，富集释放后的肽段进行蛋白组学和糖基化位点的研究。相比较于传统的链霉亲和素-生物素富集系统，本文中开发的基于温敏材料的富集系统，成本更低廉，使用更便捷。

最后，研究者利用新建立的富集策略，对三种肿瘤细胞系的糖蛋白组学进行研究，结果显示核心岩藻糖基化蛋白主要与细胞表面和细胞外基质的功能相关，O-GlcNAc糖基化主要与细胞核和DNA转录过程相关。在进行保守的糖基化位点分析中，研究者发现核心岩藻糖蛋白主要与PI3K-Akt信号通路相关，而O-GlcNAc糖蛋白主要与Notch通路相关。这个结果与前人的研究结果一致，也进一步佐证了所开发方法的可靠性。总之，这项工作为活细胞中极其多样化的糖基化修饰的同步解析提供了一个研究工具，有助于蛋白糖基化的功能研究和潜在药物新靶点的发现。

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“Two Birds One Stone” Strategy for the Site-Specific Analysis of Core Fucosylation and O-GlcNAcylation

Yawen Luo, Yuqiu Wang, Yinping Tian, Hu Zhou*, and Liuqing Wen*

J. Am. Chem. Soc., 2023, DOI: 10.1021/jacs.3c02976

导师介绍

文留青

https://www.x-mol.com/university/faculty/211707 

周虎

https://www.x-mol.com/university/faculty/22884