王初团队与董甦伟团队JACS：巨噬细胞中的衣康酰化修饰

近日，北京大学化学与分子工程学院、北大-清华生命联合中心王初课题组与北京大学药学院董甦伟课题组合作在Journal of the American Chemical Society杂志上发表了题为“Discovery of itaconate-mediated lysine acylation”的论文。在这项工作中，作者利用抗体“脱靶”富集结合开放式搜索策略在巨噬细胞中发现了一种由衣康酸介导的赖氨酸上的新型翻译后修饰——衣康酰化修饰，并对该修饰及其前体衣康酰辅酶A在免疫响应过程中的动态变化进行了表征。该修饰的发现为解释衣康酸发挥免疫调控功能的机制提供了新的线索。

衣康酸(itaconate)是一类近年来发现具有免疫调控活性的内源代谢物小分子，它被发现在病原菌刺激后的巨噬细胞中大量生成，据报道衣康酸在激活后的巨噬细胞内最高浓度可达毫摩尔水平。细胞内高浓度的衣康酸可通过结构中的亲电性α,β-不饱和羧酸结构对蛋白上的重要半胱氨酸残基进行迈克尔加成，这翻译后一修饰也被称为“衣康酸修饰(itaconation)”。衣康酸修饰此前被报道能够修饰KEAP1，NLRP3，JAK1等蛋白，进而对天然免疫过程进行调控，王初课题组此前也通过竞争性ABPP策略以及生物正交的化学探针实现了巨噬细胞以及病原菌中衣康酸修饰位点的大规模研究(详见号外 | 王初课题组和陈兴课题组合作开发半胱氨酸糖探针揭示衣康酸对糖酵解的负反馈调控，号外 | 王初课题组发展新型探针大规模分析炎症巨噬细胞中的衣康酸修饰，号外 | 王初课题组发展沙门氏菌中的衣康酸修饰组学鉴定新方法)。但近年来有研究指出，衣康酸的酯键/酰胺键衍生物在巨噬细胞内并不具有与衣康酸完全一致的生物学效应，说明衣康酸很可能还存在着其它的调控途径，但截至目前，尚无其它由衣康酸介导的修饰形式被报道。

作者在研究巨噬细胞经衣康酸处理后琥珀酰化修饰的水平变化时，发现衣康酸的处理并没有对鉴定到的琥珀酰化位点数目产生明显的影响。为了探究在这一过程中是否产生了新的翻译后修饰，作者使用MSFragger软件对质谱数据进行了开放式搜索。与预期一致的是，在结果中能够看到最主要的峰来自于琥珀酰化(Δm=100.0160)，以及一个Δm=114.0311的峰对应于已知的戊二酰化修饰。除此之外，在衣康酸处理后的样品中出现了一个无法与任何已知的翻译后修饰所对应的峰(Δm=112.0162)。进一步地通过固定质量搜索，作者发现该修饰的数目随着衣康酸的处理有着大幅的上升。对修饰质量进行精确匹配后能够将修饰的分子式确定为C5H4O3，这一分子式正好吻合衣康酸通过结构中的羧基与赖氨酸所形成的酰化修饰。

赖氨酸上的酰基化修饰通常以对应的酰基辅酶A作为前体。近年来有报道在巨噬细胞、肝癌细胞等细胞系中检测到了衣康酰辅酶A的存在，但这些研究大都关注于衣康酰辅酶A对于特定酶活的抑制，且衣康酸是利用结构中的哪个羧基来形成衣康酰辅酶A一直以来都缺乏实验上的证据。为了确定衣康酰辅酶A是否在巨噬细胞内生成以及其结构中辅酶A连接的位置，作者合成并纯化了辅酶A位于不同羧基上的两个衣康酰辅酶A异构体(C1和C4)，基于酰基辅酶A在二级质谱上特征性的-507 Da的中性丢失建立了对衣康酰辅酶A的靶向检测方法。利用新的检测手段，作者在所使用的RAW264.7巨噬细胞系中检测到了内源衣康酰辅酶A的存在，且发现其含量随着外源衣康酸的加入而显著上升。通过与合成的两种异构体对比能够确认细胞内的衣康酰辅酶A选择性地发生在C4位置的羧基上。此外，在常用的几种癌细胞系中均未检测到衣康酰辅酶A的存在，暗示衣康酰辅酶A的产生与巨噬细胞行使免疫功能密切相关。

衣康酸此前被报道能够在激活后的巨噬细胞中大量生成并行使功能。作者发现使用细菌表面抗原的模拟物LPS刺激巨噬细胞后，细胞内的衣康酰辅酶A含量有显著的上升。进一步的抗体富集及串联质谱结果表明，这一过程中衣康酰化修饰的水平也有显著的上调。在三次生物学重复中共鉴定到的87个高置信度的衣康酰化修饰位点中，80个位点在此前外源衣康酸处理后的细胞内也被鉴定到，这也印证了修饰来源于细胞内的衣康酸。在所有修饰蛋白中，组蛋白H2B1B上被发现同时存在7个衣康酰化修饰位点，暗示着衣康酰化修饰很可能通过表观遗传调控的方式发挥功能。此外，在多个糖酵解关键酶上也鉴定到了超过3个的修饰位点，结合此前报道中迈克尔加成形式的衣康酸修饰能够抑制糖酵解过程，本工作中鉴定到的糖酵解相关蛋白上的衣康酰化修饰可能也对酶活具有调控效果。

最后，为了证实这一修饰的结构是推测中的衣康酰化的形式，作者合成了带有衣康酰化修饰的赖氨酸单体，并结合多肽固相合成得到了衣康酰化修饰的标准肽段。通过使用带有重标同位素的赖氨酸(+8 Da)，能够得到在修饰位点上相比天然修饰肽+8 Da的重标修饰肽。作者将重标修饰肽掺入到抗体富集得到的内源修饰肽样品中，再一同送入LC-MS/MS检测，结果显示合成的重标修饰肽与内源的修饰肽具有完全一致的色谱保留时间和二级谱图，并且仅在包含了修饰位点赖氨酸的b/y离子上具有+8 Da的质量位移，这些结果都进一步证明了在巨噬细胞内鉴定到的新修饰的确是衣康酰化修饰。

总之，本工作首次在巨噬细胞中发现了衣康酰化这一全新翻译后修饰的存在。这一修饰来源于衣康酸的下游代谢产物衣康酰辅酶A，且修饰的水平随着巨噬细胞的激活过程有显著的上调。未来，该修饰在细胞内发挥的功能以及细胞内是否存在修饰酶或去修饰酶等重要问题均有待后续的研究。从衣康酸这一免疫调控小分子的角度来看，衣康酰化修饰的发现也为解释衣康酸参与天然免疫调控的机制提供了一条全新的路径。另外，本工作采用的抗体“脱靶”富集+开放式搜索策略也为在复杂蛋白质组中发现其它新型翻译后修饰提供了一种新思路。

本文的共同通讯作者为北京大学化学与分子工程学院、北大-清华生命科学联合中心的王初教授和北京大学药学院董甦伟教授。王初课题组2019级博士生刘东阳、博士后肖伟弟、董甦伟课题组2022级硕士生李昊亭为本文的共同第一作者，王初课题组博士毕业生张艳玲，博士后袁守丽和2019级本科生李成蹊等合作者为本课题做出了贡献。该工作得到了科技部国家重点研发计划（2022YFA1304700）、国家自然科学基金委重大研究计划（92153301）、北京分子科学国家研究中心等项目的经费支持。

本文作者：LDY

责任编辑：JGG

原文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.3c02332 

文章引用：DOI：10.1021/jacs.3c02332