CYP3A4特异性荧光底物的理性设计及其在功能成像和药物相互作用研究中的应用

稿件来源：上海中医药大学交叉科学研究院

细胞色素P450 3A4 (CYP3A4) 是人体最重要的药物代谢酶之一，负责众多异物质的代谢清除及代谢活化。多种临床药物或毒素可被CYP3A4代谢活化生成高反应性的代谢中间体，后者可与CYP3A4或其它机体功能蛋白共价结合进而引发代谢功能障碍和药物不良反应(如特异质肝毒性)。CYP3A4的表达和功能不仅受遗传、生理、病理等多种因素的调控，还可被多种药物、草药及食品化学成分所调控。因此，开发可靠、实用的CYP3A4酶活检测工具将极大地促进复杂生物体系中CYP3A4抑制剂/诱导剂的高通量筛选和表征。近期，上海中医药大学葛广波教授团队与西北工业大学杨慧教授团队合作，借助基于结构的特异性配体设计策略成功构建了一种高特异性的CYP3A4双光子荧光底物 (F8)。该底物对CYP3A4显示了优异的亚型特异性和高亲和力，且具有高检测灵敏度和良好的生物兼容性，为活细胞和活体层面开展CYP3A4的功能成像分析和药物相互作用风险评价等研究提供了实用的工具分子（图1）。相关工作近期在线发表在美国化学会药学领域著名学术刊物Journal of Medicinal Chemistry 上。

图1. CYP3A4特异性底物F8的工作原理及其特异性分析

虽然CYP3A4的多种生理底物(如睾酮)和药物底物(如咪达唑仑)已被FDA推荐用于CYP3A4抑制剂的筛选和表征。但这些生理底物/药物底物及其代谢产物的定量分析需要借助基于质谱的检测方法来实现，该方法往往需要繁琐的样品前处理过程、昂贵的检测设备和专业的操作人员。相比之下，基于荧光底物的生化检测方法为复杂生物样品中的目标酶活性检测和基于活细胞的药物筛选等提供了高效实用的方法，并被广泛用于酶抑制剂的高通量筛选、复杂生物体系中目标酶的功能成像和活性示踪等研究。但令人遗憾的是，到目前为止，可靠且实用的CYP3A4特异性光学底物鲜有报道。为此，该研究采用基于靶蛋白结构的特异性底物设计策略来发现CYP3A4候选荧光底物。研究者首先从12个具有平面多环结构的荧光团中筛选发现了一个双光子荧光团(F1)具有成为CYP3A4特异性底物的潜质。在第二轮底物结构优化中，研究者将计算机虚拟筛选与P450酶反应表型分析实验相结合，发现了一个理想的CYP3A4荧光底物(F8)。进一步对F8检测CYP3A4酶活的特异性、灵敏度和酶学属性等进行了细致表征，发现F8具有优异的亚型特异性和超高的检测灵敏度（对CYP3A4的检测下限达0.1 nM）。由于F8的羟化产物（4-羟基F8）具有良好的荧光量子产率和双光子吸收属性，研究者将F8成功用于组织制备物、活细胞和器官切片等多种复杂生物样本中CYP3A4活性的实时定量监测和原位可视化分析。此外，F8还被用于CYP3A4抑制剂的高通量筛选和抑制能力的体内外表征，并表现出了良好的实用性。

图2. 特异性荧光底物(F8)的理性设计策略及其生物医学应用

上述工作得到了国家自然科学基金优秀青年基金（81922070）、面上项目和青年基金（82273897, 81973286, 82141203, 32101202）的支持。此外，安徽大学孟祥明教授团队对该项目的双光子成像分析提供了技术支持和帮助！

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Rationally Engineered CYP3A4 Fluorogenic Substrates for Functional Imaging Analysis and Drug–Drug Interaction Studies

Rong-Jing He, Zhen-Hao Tian, Jian Huang, Meng-Ru Sun, Feng Wei, Chun-Yu Li, Hai-Rong Zeng, Feng Zhang, Xiao-Qing Guan, Yan Feng, Xiang-Ming Meng, Hui Yang*, and Guang-Bo Ge*

J. Med. Chem., 2023, DOI: 10.1021/acs.jmedchem.3c00101