半花菁比率荧光探针在细胞线粒体和斑马鱼中ClO-和粘度的双响应检测及成像研究

活性氧 (ROS) 是一类含氧生物活性小分子，在生物体内的许多生理过程中发挥重要作用。HClO作为一种重要的ROS，在生物体内有助于消灭入侵的细菌或病原体，然而，过高浓度的HClO会破坏体内DNA，从而导致囊性纤维化、阿尔茨海默症、细胞恶性肿瘤等多种疾病的发生。同样，细胞内线粒体基质的粘度也会影响细胞的呼吸状态，线粒体粘度过高可引起线粒体肿胀，引发糖尿病、帕金森病、阿尔茨海默症等多种疾病。因此，检测线粒体中HClO含量和粘度变化对了解线粒体反应动力学机制，为疾病诊断和治疗提供潜在策略具有重要意义。荧光探针由于其出色的灵敏度已成为监测生物系统的最佳技术之一，目前虽然已有多种荧光探针被开发并分别用于检测HClO含量和粘度，并表现出较高的灵敏度和低毒性，但是这些荧光探针大多水溶性较差，且在单一波长检测荧光强度变化。针对这些问题，许昌学院许志红课题组与河南理工大学王元课题组、英国巴斯大学Tony D. James课题组合作，设计开发出一种基于半花菁结构的水溶性双响应比率荧光探针，可实现线粒体中ClO^-和粘度的识别，并成功用于细胞线粒体和斑马鱼中ClO^-和粘度的同时成像检测（图1）。

图1. 基于半花菁的双响应比率荧光探针的应用及作用机制

光谱响应实验表明荧光探针对粘度和ClO^-具有良好的响应，在纯HEPES缓冲液 (50 mM，pH 7.4) 中，探针在628 nm处的荧光强度随着溶液粘度提高而增强（图2a），当甘油浓度达到99%时，其荧光强度增强约20倍，且不受其他溶剂的影响（图2b）。同时探针对ClO^-有良好的特异选择性识别，反应在10 s内即可完成且不受其他分析物的干扰。随着ClO^-的加入，探针628 nm处荧光淬灭的同时在493 nm处产生一个较强的发射峰（图2c），伴随溶液颜色由粉色变为无色（荧光颜色是深红色变为绿色）。在0 ~ 21.0 μM范围内ClO^-浓度与探针比率荧光强度比呈现良好的线性关系（图2d），检出限为0.082 μM。通过核磁、高分辨质谱、DFT理论计算等手段，推测出探针对ClO^-识别和粘度检测作用机制。

图2. 探针对粘度和ClO^-含量检测荧光光谱图

最后，作者对探针的细胞毒性及其在活体细胞中的应用做了系统研究。结果显示，在30 μM浓度下C6细胞的存活率超过83%，说明探针具有较低的细胞毒性。另外通过Mito-Tracker Blue共定位实验，确定探针具有良好的线粒体靶向功能（图3）。在活体细胞实验中，作者通过对C6细胞和斑马鱼进行制霉菌素预处理对比实验（图4，图5），证明该探针的荧光变化可以作为监测活体细胞粘度变化的有效信号。同时，通过对C6细胞和斑马鱼进行HClO和脂多糖（LPS）预处理对比实验（图6，图7），证明该探针可通过荧光信号变化检测活体细胞内源和外源ClO^-含量。

图3. 探针在C6细胞线粒体内荧光共染成像图

图4. 探针在C6细胞中检测粘度的共聚焦荧光成像图

图5. 探针在斑马鱼中检测粘度的共聚焦荧光图像图

图6. 探针在C6细胞中检测ClO^-的共聚焦荧光成像图

图7. 探针在斑马鱼中检测ClO^-的共聚焦荧光成像图

综上所述，该工作报道了一种新型线粒体靶向比率荧光探针，其可以同时检测线粒体中ClO^-含量和粘度。该探针在生物应用方面表现出响应时间短、灵敏度高、细胞毒性低、生物相容性好等特点，并成功用于C6细胞和斑马鱼线粒体中HClO含量和粘度检测。

这一研究成果近期发表在Sens. Actuators B: Chem.上，许昌学院许泗林博士和河南理工大学硕士研究生郭芳芳为论文共同第一作者，许昌学院许志红教授、河南理工大学王元教授、英国巴斯大学Tony D. James教授为论文通讯作者。

该工作得到了国家自然科学基金、国家公派留学基金、河南省自然科学基金项目、许昌学院科研创新团队、河南师范大学化学化工学院开放基金等项目经费的支持。

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面，或点此查看原文）：

A hemicyanine-based fluorescent probe for ratiometric detection of ClO^- and turn-on detection of viscosity and its imaging application in mitochondria of living cells and zebrafish

Si-Lin Xu¹, Fang-Fang Guo¹, Zhi-Hong Xu*, Yuan Wang*, Tony D. James*

Sens. Actuators B: Chem., 2023, 383, 133510. DOI: 10.1016/j.snb.2023.133510