西南交大崔树勋课题组ACS Macro Lett.：仿生肌联蛋白的DNA串联发卡的单分子力学研究

肌联蛋白（Titin）是肌肉中的重要蛋白，它由多个串联结构域组成，对肌肉的机械性能至关重要。通过将串联模块化结构引入到合成聚合物中，可以制备出机械性能优异的聚合物材料。然而，人工合成聚合物的制备过程繁杂且不易于大规模制备，这很大程度上阻碍了模块化仿生肌肉材料的发展和应用。

图1. 仿生Titin模块化DNA的设计及表征。

西南交通大学崔树勋（点击查看介绍）课题组和普渡大学毛成德教授（点击查看介绍）、湖南大学聂舟教授（点击查看介绍）合作，设计并制备出具有多发卡结构的单链DNA（Multi-hairpin DNA，MH-DNA），并利用基于原子力显微镜的单分子力谱技术（AFM-based SMFS），发现MH-DNA不仅表现出与Titin相当的结构稳定性，而且具有快速重折叠动力学以及高机械能效等特性，这些特性为MH-DNA作为构建先进材料的基础模块提供了有力条件。

图2. MH-DNA合成方法及结构预测示意图。

基于滚环扩增技术（Rolling circle amplification，RCA）可以便捷地制备多重复序列DNA（图1a）。该研究中，所合成MH-DNA由多个串联重复序列组成，其中每个重复序列可形成一个具有茎环结构（9 bp + 4 nt）以及无结构序列（24 nt）的单元结构，如图2b所示。MH-DNA的模块化结构可以很好地模仿Titin分子：串联的茎环（发卡）结构对应折叠的蛋白结构域（Domains），而无结构序列则对应位于蛋白结构域之间的连接子（Linkers）。

图3. 利用AFM-based SMFS观察MH-DNA的解折叠。

AFM-based SMFS技术已被广泛用于探究单分子的纳米力学性能。简单来说，通过操纵AFM探针捕获并拉伸吸附在基底表面的MH-DNA分子，便可获得该分子所受拉力随拉伸距离变化的信息，即力-拉伸（F-E）曲线。随着MH-DNA被逐渐拉伸直至解折叠为单链DNA，其F-E曲线展现出典型的锯齿峰形状（图3a）。相邻锯齿峰间距为~12 nm（图3b），与单个发卡结构解折叠前后的理论长度差值相当（11.0 nm），表明每个小的锯齿峰代表了MH-DNA中单个发卡结构的解折叠。通过测量不同加载率下发卡结构的解折叠力，可以得到其动力学解折叠力谱（图3c）。根据Bell-Evans模型，模块化发卡结构的解折叠力与加载率的指数呈线性相关，表明发卡结构在该研究体系中表现为非平衡转变（Non-equilibrium transition）。同时，通过使用Bell-Evans模型拟合动力学解折叠力谱可以获得发卡结构的解折叠动力学参数：天然解折叠率（Native unfolding rate）k_u = (1.4 ± 0.1) × 10⁻⁴s⁻¹，以及折叠态到转变态的距离Δx_u= 2.3 ± 0.1 nm。值得注意的是，此处发卡结构的k_u值与先前报道的Titin的k_u值（10⁻⁵−10⁻³s⁻¹）相当，表明两者具有相当的结构稳定性。

图4. 通过动力学力谱探究模块化发卡结构的完整动力学参数。

进一步，拉伸-松弛测试用以探究MH-DNA的重折叠动力学（图4a）。如图3b和3c所示，MH-DNA的两条相邻拉伸-松弛曲线能够较好地重叠，一方面显示出MH-DNA的可逆解折叠，另一方面也表明其具有显著的低迟滞特性。这些分子特性意味着MH-DNA可以作为能够快速折叠以及具有高能效的理想分子弹簧。结合动力学重折叠力谱，完整的动力学参数被用于构建模块化发卡结构的自由能景观（图4d和4c）。其中，天然重折叠率k_f = (3.3 ± 0.2) × 10⁷ s⁻¹，解折叠态到转变态距离Δx_f = 6.2 ± 0.5 nm，以及两态间自由能差ΔG = ~65 kJ/mol。所构建的模块化发卡结构的自由能景观展现出一个不对称的双势阱，沿解折叠方向势阱较为陡峭，而朝向重折叠的路径则显得更为平缓。完整的自由能景观进一步揭示了MH-DNA作为先进材料基础模块的优势：相当高的ΔG能够为材料提供充足的吸收外部能量的能力，而较长的ΔL（2.3 nm + 6.2 nm）则可以为材料提供非凡的延展性。

图5. MH-DNA尺寸分布宽泛，模块化发卡结构形成率高。

此外，MH-DNA还显示出在构建大尺寸结构上的潜力。单分子力测量结果显示，部分MH-DNA链的表观轮廓长度可达到1 μm，对应单链DNA分子尺寸~1700 nt（图5a）。该结果也得到琼脂糖凝胶电泳结果的支持，MH-DNA荧光条带分布广泛（~50 bp – ~1500 bp），对应MH-DNA分子尺寸100 nt至3000 nt（图5c）。同时，研究者们还发现，在MH-DNA的F-E曲线中随着表观轮廓长度的增加，发卡结构的解折叠峰数量呈现增加趋势，表明MH-DNA具有稳定且较高的模块化发卡结构形成率（> 60%，图5b）。根据上述结果，可以预见MH-DNA跨越一个到多个模块单元的分子设计，将促进不同尺度水平的纳米机械设备的构建。基于成熟的DNA纳米技术，相信未来将有基于模块化DNA的先进材料被设计并广泛用于诸如生物医学工程以及软体机器人技术等领域。

相关成果发表于ACS Macro Lett.。论文第一作者为曹楠普博士生，通讯作者为崔树勋教授。

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面，或点此查看原文）：

Emulating Titin by a Multidomain DNA Structure

Nanpu Cao, Wanhao Cai, Lu Qian, Zhou Nie*, Chengde Mao*, and Shuxun Cui*

ACS Macro Lett., 2023, 12, 59–64, DOI: 10.1021/acsmacrolett.2c00585

导师介绍

崔树勋

https://www.x-mol.com/university/faculty/50166

毛成德

https://www.x-mol.com/university/faculty/68955

聂舟

https://www.x-mol.com/university/faculty/10090