Anal Chem封面：电刺激对心肌组织功能影响的扫描电化学显微镜原位表征研究

心脏受病理损伤后只能靠疤痕修复，导致心脏功能下降。目前心肌组织工程是修复受损心脏功能的重要潜在工具，施加外源性电刺激（如电场强度、电能等）可诱导胚胎干细胞向心肌细胞分化、促进体外心肌组织成熟和功能化，是构建工程化心肌组织的常用手段。心肌组织具有独特的电学微环境，但以往组织工程中应用的电刺激参数主要源于实验经验值，缺乏外源性电刺激参数对心肌组织功能影响的系统研究。并且，外源性电刺激（电击、除颤、心导管消融等）可能使心肌组织产生生理甚至病理变化（如高电流导致心律失常、细胞膜破坏、代谢紊乱等），但有关电刺激导致心肌组织损伤的研究还较少。另外，电刺激还会引起心肌组织周围温度变化，更进一步影响心肌组织功能。因此，选择合适的心肌组织电刺激参数、阐明电刺激对心肌组织功能影响的作用机制对修复、维持和提高心肌组织功能十分重要。

心肌组织的呼吸活性、细胞膜通透性和搏动频率是与其代谢和电生理活动密切相关的主要功能参数，原位监测心肌组织这三个参数变化可直接反映心肌组织的功能。但以往研究方法只能表征心肌组织的单一参数，缺乏可原位、无损、同时表征心肌组织多功能参数的方法，同时缺乏电刺激后心肌组织代谢和电生理状态参数的原位动态数据。扫描电化学显微镜（scanning electrochemical microscopy，SECM）作为一种微区电化学表征技术，可实现对活细胞或组织消耗或释放化学小分子等物质的高时空分辨的原位、无标记检测，可作为原位表征心肌组织的呼吸活性、细胞膜通透性和搏动频率的理想工具。

近日，西安交通大学生命科学与技术学院仿生工程与生物力学研究所 (BEBC) 李菲（点击查看介绍）课题组应用SECM对不同电刺激参数（电场强度、电能）下体外心肌组织模型的耗氧量、细胞膜通透系数和收缩频率变化进行了原位表征，研究不同电刺激参数对心肌组织代谢和电生理状态的影响（图1）。

图1. 应用SECM原位表征电场刺激后体外心肌组织的呼吸活性、膜通透性和搏动频率的实验示意图。图片来源：Anal. Chem.

该工作首先将小鼠的心肌细胞和心肌成纤维细胞以3:1数量比在硬度为18.4±0.6 kPa聚丙烯酰胺水凝胶上培养3天，实现了体外心肌组织模型的构建，并基于钨丝电极和电信号发生仪搭建了对心肌组织施加电场刺激的实验装置。之后，应用建立的COMSOL有限元理论模型计算了心肌组织周围的电场和温度分布，得到了不使心肌组织周围产生明显温度变化的电刺激的电场强度和能量参数值（电场强度：1.19、2.37、3.39 kV cm^–1， 电场能量：0.001、0.005、0.011 J）（图2），用作心肌组织的电刺激参数。

图2. 心肌组织周围（a）电场和（c）温度分布的切面图；施加电场脉冲的（b）电势-时间曲线和（d）心肌组织表面的温度-时间曲线。图片来源：Anal. Chem.

接着，分别以甲酸二茂铁和氧气为实验体系的氧化还原电对，应用SECM探针结合可编程脉冲波形电位方法，通过同时记录两种电对的氧化或还原电流信息，实现了对施加电场刺激后心肌组织形貌和呼吸活性的同时原位表征（图3）。结果表明，当施加0.001 J的电场能量以1.19、2.37、3.39 kV cm^–1的电场强度刺激后，心肌组织的耗氧量呈明显上升趋势，这可能是由于电场刺激后心肌细胞为恢复细胞内离子稳态需要更多的能量所致。当施加0.005 J和0.011 J电场能量的电刺激后，心肌组织的耗氧量表现出更加明显的上升趋势，可能是由于电刺激破坏了细胞内离子稳态，导致线粒体NADH产生和耗氧量增加。

图3. 施加（a）0、（b）1.19、（c）2.37和（d-f）3.39 kV cm^–1电场强度和（a）0、（b-d）0.001、（e）0.005和（f）0.011 J电场能量刺激后心肌组织形貌和氧气还原电流的SECM实验结果图。图片来源：Anal. Chem.

之后，以[Ru(NH₃)₆]Cl₃为实验体系的氧化还原电对，通过检测探针向心肌组织接近过程中探针表面[Ru(NH₃)₆]Cl₃还原电流值的变化，应用SECM实现了对电场刺激后心肌组织细胞膜通透性变化的原位表征，并结合COMSOL有限元模型计算得到了细胞膜的通透系数（P_m）（图4）。结果表明，当施加0.001 J的电场能量以1.19、2.37、3.39 kV cm^–1的电场强度刺激后，心肌组织的膜通透性无明显变化，表明低能量的电场刺激未对心肌组织膜造成明显损伤。当施加0.005 J和0.011 J电场能量的刺激后，心肌组织的膜通透性明显增加，可能是由于电场刺激对心肌细胞骨架产生破坏，影响了细胞膜结构稳定性使细胞膜通透性增加。

图4. 施加了（a）0、（b）1.19、（c）2.37和（d-f）3.39 kV cm^–1电场强度和（a）0、（b-d）0.001、（e）0.005和（f）0.011 J电场能量刺激后心肌组织的SECM实验渐进曲线和理论渐进曲线；(g) 电场刺激后心肌组织不同时间的平均膜通透性系数P_m值。图片来源：Anal. Chem.

最后，以[Ru(NH₃)₆]Cl₃为氧化还原电对，通过检测心肌组织搏动时探针表面[Ru(NH₃)₆]Cl₃还原电流值的变化，应用SECM原位表征了电刺激后心肌组织搏动频率的实时变化（图5）。结果表明，当施加0.001 J电场能量以1.19、2.37、3.39 kV cm^–1的电场强度刺激后，心肌组织的搏动频率出现下降趋势，并在刺激后60 分钟开始逐渐恢复到电刺激前的搏动频率。在施加电场能量分别为0.005和0.011 J刺激后20和40 分钟，心肌组织搏动频率的最小值与电场强度和电能呈负相关，且收缩频率的变化幅度随电场强度的增大而增大。可能是由于伴随电场强度的增加，细胞膜去极化情况增加，导致心肌组织收缩频率产生变化。

图5. 施加（a）0、（b）1.19、（c）2.37和（d-f）3.39 kV cm^–1电场强度和（a）0、（b-d）0.001、（e）0.005和（f）0.011 J能量的电场刺激后心肌组织搏动频率的电流-时间曲线和心肌组织的搏动频率-时间关系图。图片来源：Anal. Chem.

该工作首次应用SECM对电场刺激后心肌组织功能进行了原位定量表征，实验结果有助于理解外源性电场环境对心肌组织功能的影响，可为临床电疗（如除颤、心脏导管消融等）提供心肌组织功能参数的原位表征数据参考。该研究成果发表在美国化学会杂志Analytical Chemistry 上，并被选为期刊封面文章。文章第一作者是西安交通大学博士生叶朝阳，通讯作者为西安交通大学李菲教授，其他作者还包括西安交通大学研究生李亚北、赵宇翔、张俊杰、朱彤和徐峰教授等。该工作也得到美国哈佛仪器公司Frank Wang博士在SECM仪器方面的帮助，以及国家自然科学基金、陕西省自然科学基金、陕西省重点研发计划和中央高校基本科研业务费等的资助。

李菲教授课题组遵循“生命科学基础问题-电化学扫描探针显微镜平台研制-细胞原位电化学成像与表征”的学术思路，立足于电分析化学方法与技术，结合组织工程学、生物力学和医学等学科，开展疾病相关细胞物理微环境对细胞生化行为的原位电化学成像和细胞界面过程动力学研究，探究细胞微环境与细胞病理学的关系。该工作是李菲教授课题组自心肌细胞和心肌组织水平的SECM应用研究后（Anal. Chem., 2020, 92, 4771; Anal. Chem., 2021, 93, 5797; Anal. Chem., 2022, 94, 10515），将研究体系拓展到电学微环境下心肌组织功能的SECM研究新成果。

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面，或点此查看原文）：

Effect of Exogenous Electric Stimulation on the Cardiac Tissue Function In Situ Monitored by Scanning Electrochemical Microscopy

Zhaoyang Ye, Yabei Li, Yuxiang Zhao, Junjie Zhang, Tong Zhu, Feng Xu, and Fei Li*

Anal. Chem., 2023, DOI: 10.1021/acs.analchem.2c04758

导师介绍

李菲

https://www.x-mol.com/university/faculty/13704 

课题组主页链接

http://gr.xjtu.edu.cn/web/feili