天津工业生物所Angew：定向进化PET解聚酶推动废弃PET塑料完全降解

随着资源与环境问题的日益严峻，废弃塑料的有效回收与再利用已成为全球性研究热点。聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）是目前应用较为广泛的一种合成塑料，PET的酶促解聚为废弃塑料的回收利用提供了一条绿色途径。IsPETase是近年来报道在常温下对PET水解活性最高的酶，但IsPETase的低稳定性限制了它的应用。因此，国内外已有许多研究团队基于IsPETase的晶体结构进行（半）理性设计，获得了一系列性能改善的突变体。定向进化也是提高IsPETase催化性能的一种有效方法，可以挖掘出远离活性位点的潜在有益突变位点，但受限于缺乏高效灵敏的高通量筛选方法。

近日，中国科学院天津工业生物技术研究所朱蕾蕾研究员带领的蛋白质定向进化研究团队与南京中医药大学刘海峰教授合作发展了一种新型的基于荧光检测的高通量筛选方法对IsPETase进行定向进化，获得的突变体DepoPETase在中温度下展示出优异的废弃PET解聚性能，并对多种废弃PET包装实现了完全解聚。

图1.（a）BHET-OH荧光法的原理；（b）PETase的定向进化流程示意图；（c）PETase的定向进化结果；（d）DepoPETase（M5）和FAST-PETase对PET的解聚性能比较。

科研人员设计并合成了一种PET水解酶的新型模型底物——BHET-OH（PET结构单元BHET的衍生物），利用其被PETase水解后能产生荧光物质TPA-OH的特性，建立了基于荧光检测的PETase水解活性微孔板筛选方法，该荧光方法也适用于其他PET水解酶。随后基于该荧光高通量筛选方法对PETase进行多轮定向进化和位点组合，获得的最佳突变体DepoPETase的T_m值提高了23.3 °C，50 °C反应48 h后，对无定型PET膜的水解活力是野生型的1407倍。将DepoPETase应用于废弃PET包装的解聚测试发现，DepoPETase在50 °C条件下实现了1.5至4.5天内对多种未经预处理的废弃PET包装的完全解聚。进而通过发酵罐放大实验实现了19.10 g未经预处理的废弃PET包装的完全解聚。通过结构分析表明，DepoPETase的有益突变主要是通过疏水作用、盐桥、氢键等相互作用，增强催化三联体附近的6个loop的网络相互作用，进而将稳定效应传递到活性中心，从而提高该酶的催化性能。

图2. DepoPETase在50 ℃对PET废弃包装的解聚性能测试。（a）不同PET废弃物的完全解聚时间曲线；（b-c）PET废弃物的物理性质对解聚性能的影响；（d）3L发酵罐中19.1 g PET废弃物的完全解聚过程。

图3. DepoPETase上的有益突变位点结构分析结果

该工作通过定向进化技术和新颖的高通量筛选方法提高了IsPETase的PET水解活性和热稳定性，为PET水解酶的分子改造提供了新思路和新方法，也为PET的酶降解循环利用提供了高效的酶催化剂。

该研究得到国家重点研发计划、天津市合成生物技术创新能力提升行动、中科院STS项目和天津市合成生物学海河实验室创新基金的支持，相关成果发表于Angewandte Chemie International Edition 期刊。天津工业生物所博士生石利霞和副研究员刘岯为该论文共同第一作者，朱蕾蕾研究员与南京中医药大学刘海峰教授为该论文共同通讯作者。

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面，或点此查看原文）：

Complete Depolymerization of PET Wastes by an Evolved PET Hydrolase from Directed Evolution

Lixia Shi, Pi Liu, Zijian Tan, Wei Zhao, Junfei Gao, Qun Gu, Hongwu Ma, Haifeng Liu, Leilei Zhu

Angew. Chem. Int. Ed., 2023, DOI: 10.1002/anie.202218390