臭氧靶向递送-微波可控释放纳米系统增敏三阴乳腺癌免疫检查点阻断疗法

三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）作为预后最差的乳腺癌亚型，在常规化疗后仍然具有较高的复发概率，目前仍然缺乏有效的治疗手段。尽管免疫检查点阻断（immune checkpoint blockades，ICBs）疗法在癌症治疗中取得了革命性的成就，但由于：a）肿瘤组织T淋巴细胞浸润不足，即所谓的“冷肿瘤”；b）肿瘤免疫抑制微环境形成（肿瘤相关巨噬细胞M2极化、调节性T淋巴细胞聚集等）；c）肿瘤相关抗原暴露不足等原因，单用ICBs对三阴乳腺癌的疗效仍然有限。近年研究者发现，诱导肿瘤发生免疫原性细胞死亡（immunogenic cell death，ICD）有望提高免疫检查点阻断疗法的疗效。在所有促肿瘤ICD策略中，通过向肿瘤提供自由基源、使细胞内产生大量活性氧（reactive oxygen species，ROS）是有效策略之一。

近日，四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室石虎兵教授团队与四川大学华西医院超声科彭玉兰教授团队合作，研发了一种肿瘤靶向的臭氧递送-微波可控释放纳米系统（iPPO），将臭氧靶向递送至肿瘤后，利用微波的非热效应将臭氧在肿瘤部位大量释放并高效促进其转化为羟基自由基，诱导肿瘤细胞发生凋亡的同时诱导肿瘤发生ICD，有效将免疫“冷肿瘤”转变为“热肿瘤”，显著提高anti-PD-1对三阴性乳腺癌的疗效。

图1. 摘要图。图片来源：J. Control. Release

作者运用经FDA批准的聚乳酸-羟基乙酸共聚物（poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA）包载全氟萘烷，以静电吸附原理将聚乙烯亚胺（poly(ethylene imine)，PEI）及聚丙烯酸（Acrylic acid Polymers，PAA）逐层自组装于PLGA外，并进行iRGD多肽修饰，稳定纳米颗粒结构的同时提高了颗粒的肿瘤靶向效果。研究人员对该臭氧肿瘤靶向递送-微波可控释放纳米系统进行了臭氧吸附、微波操控释放以及羟基自由基生成等一系列表征，结果表明该系统具备良好的臭氧载率及微波响应能力；此外，研究团队还发现微波除了能够释放PFD中的臭氧，还具有促进臭氧生成羟基自由基的能力。 

图2. iPPO合成路径及部分表征。A. 合成流程图。B. 梯度微波功率辐照iPPO释放臭氧浓度曲线。C. 固定功率微波辐照iPPO的臭氧浓度-时间释放曲线。D. 梯度微波功率辐照饱和臭氧的超纯水生成羟基自由基，以亚甲基蓝作为指示剂。E. 有/无微波辐照时iPPO羟基自由基生成定量比较。F. 固定功率微波辐照下iPPO产生的时间依赖性羟基自由基，以对苯二甲酸作为指示剂。图片来源：J. Control. Release

iPPO进入细胞后，在低功率微波辐照下，有效诱导肿瘤细胞发生凋亡，进一步促进CRT细胞膜重定位、ATP释放以及HMGB1的细胞外泌，有效诱导肿瘤细胞ICD。

图3. A. 细胞活死染色。B. CRT重定位免疫荧光染色。C. ELISA检测细胞外泌HMGB1。D. 细胞释放ATP检测。图片来源：J. Control. Release

最后，作者研究了该系统联合免疫检查点抑制剂anti-PD-1的体内肿瘤治疗效果。结果表明，臭氧肿瘤靶向递送-微波可控释放纳米系统联合anti-PD-1有效地将免疫“冷肿瘤”转变为“热肿瘤”，表现出良好的原位瘤及远端瘤杀伤效应。

此外，H&E重要脏器染色及血常规、血生化分析等实验均表明该臭氧释放系统具有良好的生物安全性。

图4. 体内肿瘤作用效应。A. 原位瘤杀伤效应。B. 远隔瘤杀伤效应。C. CD8/CD3/DAPI免疫荧光共染。图片来源：J. Control. Release

总结

作者创新地使用臭氧作为肿瘤治疗中活性氧物种供体，利用微波的非热效应释放臭氧并促进其分解从而避免了周围组织热损伤，杀伤肿瘤细胞的同时促进了免疫检查点阻断治疗，为三阴乳腺癌的免疫治疗提供了一种新型联合策略，具有较高的临床转化价值。相关研究成果发表在Journal of Controlled Release 上，四川大学华西临床医学院博士研究生宋琳琳、四川大学博士后郑丹以及四川大学华西医院徐金顺为文章共同第一作者，四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室石虎兵教授和四川大学华西医院彭玉兰教授为共同通讯作者。

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面，或点此查看原文）：

Improvement of TNBC immune checkpoint blockade with a microwave-controlled ozone release nanosystem

Song Linlin, Zheng Dan, Xu Jinshun, Xu Tianyue, Liu Zhihui, Zhang Huan, Li Yi, Peng Yulan*, Shi Hubing*

J. Control. Release, 2022, 351, 954-969, DOI: 10.1016/j.jconrel.2022.09.053

石虎兵简介

石虎兵，教授、博士生导师，清华大学分子生物学与生物化学博士；后在美国加州大学洛杉矶分校从事肿瘤分子靶向治疗耐药性机理以及肿瘤免疫治疗研究。国家“十三五”重点研发计划“精准医学研究”项目负责人（首席科学家）；国家高层次青年人才计划，四川省高层次人才计划，四川省学术技术带头人，四川省卫健委领军人才。

主要利用纳米技术结合高通量交叉组学，从事以MAPK分子靶向和PD-1-PD-L1免疫检测点抑制的精准个体化治疗机理研究。提出BRAF与MEK，MEK与 PI3K/mTOR以及MEK与AKT等联合靶向用药方案，据此GSK，Merck，和Roche等大型制药公司的数十个临床试验正在进行或已完成。作为骨干参与自主研发的HSP90定量检测试剂盒被评为“十二五”重大原创性科技成果，研发的以肿瘤标志物核仁素为精准个体化用药指导的国家一类新药M2ES进入二期临床。

研究期间共发表研究论文50余篇，影响因子超过1000，被引用10000余次，撰写专著2项，以第一作者或通讯作者（含共同）身份共发表论文二十余篇，包括：Nature，Cell，Cancer Discovery（3篇），Cancer Cell，Signal Transduction and Targeted Therapy，Nature Biomedical Engineering，Nature Communications，Blood（封面文章），Advanced Functional Materials（封面文章），Genome Research（封面文章），Cancer Research等。

彭玉兰简介

彭玉兰，博士研究生导师，超声医学科学科主任，国家卫健委两癌筛查乳腺癌筛查超声技术培训专家，四川省卫健委两癌筛查专家，四川省卫健委学术技术带头人。长期致力于乳腺癌的影像、临床及基础研究。研究方向涵盖数据挖掘、数据结构化和标准化、乳腺超声图像人工智能CAD研究，以及乳腺癌基础研究。研究期间通过NLP等技术构建乳腺超声-病理专病数据库，包含2002-2022年累计百万数据。获得8项计算机软件著作权，获批2项专利，申报受理2项发明专利。主持国家级和省部级等科研课题14项，主持教学课题5项，发表中英文论文100余篇，累计培养博士和硕士研究生包括留学生共计30余名。