陈丽霞/李华教授等提出＂靶向降解组学＂新概念用于中药成分靶点鉴定

近日，结构药理学与药物化学实验室在药学领域顶级期刊Acta Pharmaceutica Sinica B（APSB）发表了题为“PROTAC Technology as a Novel Tool to Identify the Target of Lathyrane Diterpenoids”的研究(doi.org/10.1016/j.apsb.2022.07.007, IF=14.9)，创造性地提出靶向降解组学（Targeted Degradomics）的化学生物学新概念，用于中药成分靶点的鉴定。沈阳药科大学无涯创新学院博士生吴艳丽、杨月影和王望为文章共同第一作者，陈丽霞教授和李华教授为文章共同通讯作者，该研究最早于今年2月份发布于化学预印本网站ChemRxiv（10.26434/chemrxiv-2022-5t93k）。

活性中药成分及天然产物因其独特的生物相容性、新颖的结构和广泛的药理活性，是先导化合物和新药发现的源泉，其作用靶点的鉴定是理解作用机理和指导后续结构优化的关键。然而通常来说，中药成分及天然产物的药效是通过与多个靶点的相互作用来实现的，它们与靶蛋白的亲和力并不很强，这种作用机制的复杂性为其靶点鉴定带来很大挑战。对于中药成分及天然产物的靶点鉴定，目前主要有三种方法：基于亲和力的靶点鉴定、基于活性的蛋白质谱分析（ABPP）和无标签的靶点鉴定。ABPP专门用于识别功能活性蛋白质，如酶。传统的基于亲和力的下拉方法取决于小分子化合物和靶点蛋白质的瞬时结合，这种结合需要足够强，以便从整个蛋白质组中分离目标蛋白质；此外，下拉分析的准确性受实验设计和操作方面的显著影响。现有的无标签靶点识别方法，如DART或CETSA联合质谱法等，也受到靶标－小分子结合亲和力和靶标蛋白对蛋白水解或热变性敏感性的限制。

蛋白靶向嵌合体（PROTAC）技术已被广泛用于合成活性更好的双功能小分子抑制剂，由于PROTAC降解靶蛋白并不需很强的亲和力，因此研究团队大胆猜想该技术可用于鉴定中药成分及天然产物的作用靶点。为了验证此概念，本研究合成了从千金烷二萜类化合物Lathyrol和CRBN配体沙利度胺衍生的ZCY-PROTAC，并通过比较定量蛋白质组学发现，MAFF蛋白是Lathyrol的潜在靶点，可被ZCY-PROTAC显著降解。进一步的生化和药理学实验，验证了Lathyrol及其活性衍生物ZCY020能够直接与MAFF结合，并且在体内外通过MAFF-Nrf2途径发挥抗氧化和抗炎作用。更深入的机制研究表明，千金烷二萜ZCY020抑制MAFF同源二聚体的形成，然后促进MAFF-Nrf2异二聚体，以调节HO-1的下游表达，从而在LPS诱导的炎症中发挥抗氧化和抗炎活性。本研究表明MAFF是lathyrane二萜类化合物的潜在靶标，同时也证明了PROTAC技术用于中药成分及天然产物靶标鉴定的可行性和可靠性。

千金烷二萜类化合物是中药千金子（Euphorbia lathyris L.）的主要活性成分，具有广泛的生物活性，包括抗炎、抗肿瘤、抗肿瘤多药耐药等。近年来，研究团队对千金子中分离和衍生化的千金烷二萜类化合物进行了系统的抗炎活性研究，发现该类型的多个化合物具有良好的抗炎活性（Journal of Natural Products, 2019, 82: 756-764; Bioorganic Chemistry, 2021, 112: 104944-104954; Phytochemistry, 2021, 190: 112846-112859; Bioorganic Medicinal Chemistry, 2022, 56, 116627; Chemistry & Biodiversity, 2020, 17: e1900531.）。然而，千金烷二萜类化合物的确切作用靶点和抗炎机制目前仍不清楚，而确定其作用靶点可以更好地阐明其抗炎作用的分子机制，为后续优化结构和合理药物设计、寻找抗炎活性更好的先导化合物奠定基础。

本研究创造性地利用PROTAC技术探索中药成分的靶点，以中药成分衍生的PROTAC分子为探针，然后将中药成分及其PROTAC分子分别处理后的细胞裂解液，进行差异蛋白质组学的测定和分析，结合KEGG通路分析等生物信息学方法，从被降解的差异蛋白质中挑选出候选靶蛋白，再通过体外靶点验证方法MST、CETSA和DARTS、RNAi技术、体内靶点相关通路验证等实验进一步确证该中药成分的作用靶点蛋白。在这里，该研究将PROTAC分子探针与定量蛋白质组学相结合的方法，称之为”靶向降解组学（Targeted Degradomics）”，可以为中药和天然产物的靶点鉴定提供新方法，并可用于发现已知药物的新作用靶点，值得进一步应用和研究。

与基于亲和力的靶点鉴定不同，基于PROTAC方法的靶点鉴定并不总是需要靶点蛋白与化合物之间的强结合，而是依赖于靶点-PROTAC-E3连接酶三元复合物的形成。此外，这种三元复合物甚至可以稳定微弱的配体-靶蛋白相互作用，导致靶点的有效降解，并提高配体的选择性。只要观察到靶点蛋白的降解，该方法就是有效的。此外，对于中药成分或天然产物，它们往往作用于多个靶点，并且与靶点蛋白的结合亲和力偏弱或适中，基于亲和力的靶点鉴定方法更容易得到假阳性或假阴性结果。因此，基于PROTAC方法的靶点鉴定将是目前可用方法的一个很好替代和补充。此外，基于PROTAC的靶点鉴定，其读出的是比较定量蛋白质组学的最终降解结果，在某种程度上是一个放大的信号；而且，由于省略了基于亲和探针方法所需的下拉分析，可以消除由于实验设计和操作导致的误差。

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