线粒体是细胞内的“能量工厂”，其呼吸作用产生的过量活性氧(ROS)会造成自身的损伤。通常，细胞能够通过自噬来清除损伤的线粒体，然而异常的线粒体自噬可能导致神经和心血管甚至某些癌症等疾病。因此，研究线粒体自噬的分子机制对深入理解其生理学和相关疾病极其重要。根据线粒体和酸性溶酶体融合机制，设计适用的pH敏感荧光探针是研究线粒体自噬动力学的有效手段。然而，pH响应荧光探针大多基于单个响应基团的质子化与去质子化，因此使用这些探针进行的细胞内pH测量范围娇小，无法满足线粒体自噬追踪的要求。理想的读数应在pH 5.0-8.0范围内，完全覆盖从线粒体到溶酶体的pH范围。然而，将多个pH敏感基团、线粒体定位基团、生物相容性增强基团等多种功能到单个探针中一直在挑战探针的工程设计。在中瑞合项目、国家自然科学基金等资助下，安徽大学与瑞典林雪平大学合作报道了一种多功能宽pH响应纳米新探针，有效解决了这些困难。

基于前期的科研成果（Small, 2021, 17, 2101440, https://doi.org/10.1002/smll.202101440），利用纳米材料可修饰性的优势，在单一纳米粒子中同时整合酸性敏感的罗丹明B荧光团、碱性敏感的荧光素荧光团、线粒体定位基团PPh³⁺（TPP）、巯基介导细胞摄取基环状二硫基（CPCDs）、以及生物相容性片段等。所得探针分子在pH 3.0-8.0的较宽范围内敏感，且细胞摄取速度在30 min达到饱和，克服了分子探针设计的难点，实现了对整个线粒体自噬过程中的pH变化进行比率分析。

图1 宽范围响应的pH探针的设计

罗丹明B（pH 4.5-5.5敏感）和荧光素（pH 6.0-8.0敏感）发射分别在580和520 nm处，不适合观测线粒体自噬的整个过程，通过将二者引入到单一纳米颗粒，同时调节罗丹明B和荧光素之间的比例为3：1时，实现了探针分子（FR-TPP）具备宽范围pH 4.0-8. 0的响应能力，进一步偶连三苯基膦盐基团，赋予纳米探针定位线粒体的能力。作者还在体外通过稳定性等实验，确认了探针分子只对pH敏感，而不受其他生物分子干扰。

图2 线粒体自噬过程的实时追踪

探针FR-TPP可以通过双通道模式监测线粒体自噬过程中pH的动态变化。在正常的培养基中，细胞线粒体发出强的绿色荧光，红色溶酶体通道没有荧光；当使用CCCP诱导时，线粒体内绿色荧光在逐步降低，而红色通道发光明显增加。而且随着时间推移，线粒体和溶酶体的重叠系数在逐渐升高，表面线粒体自噬在逐渐增强。为了进一步说明这一问题，作者使用了蛋白印迹的实验方法，自噬标志性蛋白LC3-II在逐渐升高，p62在逐渐减少，证明了探针FR-TPP适合监测线粒体自噬过程中pH的波动。

张瑞龙，2016年获中国科学技术大学博士学位，现就职于安徽大学化学化工学院。研究方向为荧光探针与细胞成像，针对特定细胞事件中不同的生物分子，发展多响应型单分子荧光探针揭示生物分子和细胞器动力学，以第一/通讯作者身份在JACS、Angew、Anal. Chem.等杂志发表多篇论文。目前主持国家自然科学基金2项。另外，本课题组具有优质的设备平台、待遇丰厚、经费充足，更有薪资优厚的全职博士后名额，期待您的加盟。

Zhangjun Hu, Assoc. Prof. in Molecular Surface Physics and Nanoscience (MOLYT) division (https://liu.se/en/organisation/liu/ifm/molyt), Department of Physics, Chemistry and Biology (IFM), Linköping University, Sweden. His current research interests focus on the fluorescent molecules, complexes, and nanomaterials for biomedical imaging/sensing, and the functional materials for new sustainable purposes. We are always looking for qualified and motivated visiting study and research. If you are interested in researching with us, please contact us.

X. Zhang, J. Chen, J. Hu, et al. Single-wavelength-excited fluorogenic nanoprobe for accurate real-time ratiometric analysis of broad pH fluctuations in mitophagy. Nano Research. https://doi.org/10.1007/s12274-022-4325-3.

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