南科大贾铁争课题组JACS：兼容生物分子的硫亚胺脱氢Chan-Lam偶联反应

2009年，Hudson课题组在IV型胶原蛋白里首次发现了天然生物大分子内硫亚胺（S=N）的存在，并揭示出这一结构是多细胞生物面对机械压力的一种进化策略（Science 2009, 325, 1230）。随后，硫亚胺在化学与生物学领域受到越来越多的关注，比如加州大学的Chang/Toste联合研究团队发展了基于蛋氨酸氧化亚胺化反应制备硫亚胺衍生物的特异性生物标记策略，可用于在蛋白质组水平上活性蛋氨酸位点的确定（Science 2017, 355, 597）。山东师范大学的唐波教授课题组也报道了一类新颖的基于分子内硫亚胺结构的小分子荧光探针，可用于细胞水平以及斑马鱼胚胎中HOBr浓度的检测（Angew. Chem. Int. Ed., 2016, 55, 12751）。因此，在生物大分子中，特别是多肽和蛋白质上引入硫亚胺结构，将赋予其独特的化学物理性质与新颖的生物活性。然而，N-芳基硫亚胺的传统合成方法，需要强氧化剂或者强碱性条件，因此底物范围受限，无法在生理条件下兼容结构复杂的生物大分子，限制了硫亚胺在药物化学以及化学生物学的进一步研究应用。

南方科技大学化学系贾铁争（点击查看介绍）课题组致力于高价硫化物的合成与转化方法学研究（Nat. Commun. 2020, 11, 2890; ACS Catal. 2020, 10, 2633; Nat. Commun. 2021, 12, 932）。近日，受亚砜配体与金属配位过程中内壳单电子转移机制的启发，该课题组报道了一种氧化还原中性的硫亚胺脱氢Chan-Lam偶联方法，其具有催化体系简单、反应条件温和与化学选择性优良等优势，使得该方法被成功应用于多肽以及蛋白的化学标记中（图1），相关成果发表于化学旗舰杂志Journal of the American Chemical Society。

图1. 生物分子兼容的脱氢Chan-Lam偶联反应

作者首先以NH-二苯基硫亚胺和4-甲基苯硼酸为模板底物，经过一系列的条件优化后确定了最优的反应条件为NH-二苯基硫亚胺1a（1.0 equiv），4-甲基苯硼酸2a（1.5 equiv），CuBr（5 mol %），以iPrOH为溶剂（0.1 M），氩气气氛、室温条件下反应24 h，目标产物的分离收率可达99%。需要特别指出的是，尽管该反应无需外加氧化剂的参与，但却可以成功兼容空气氛围，也为后续生物标记的顺利开展奠定了基础。

在确定了最优的反应条件后，作者对反应的底物普适性进行了考察（图2），该方法对于硼酸以及硫亚胺类底物均表现出良好的官能团兼容性。需要指出的是，当以酪氨酸硼酸衍生物2o为硼酸底物时，也能够以87%的收率生成相应的偶联产物3ao，表现出了良好的化学选择性。此外，N-Ar-烷基芳基硫亚胺也能通过该方法以较高的收率得到（3op, 3pp）。

图2. 底物范围拓展。图片来源：J. Am. Chem. Soc.

受到酪氨酸硼酸衍生物3ao的启发，作者将这一铜催化Chan-Lam偶联方法应用到了多肽分子的修饰中（图3）。通过对含酪氨酸硼酸衍生物的二肽底物的考察发现，反应具有较高的化学选择性，可以很好地兼容氨基酸残基中的-OH、-SH、吲哚-NH以及-CONH₂官能团。在二肽的氨基酸序列中，酪氨酸硼酸衍生物位于氮端或者碳端，对反应的收率并没有明显的影响。该反应对于含酪氨酸硼酸衍生物的三肽底物同样适用（5i-5m），以68%-96%的收率，获得了相应的偶联产物。接下来作者考察了更为复杂的四肽、五肽分子，包括两种内源性多肽分子endomorphin-1（5s）、met-enkephalin（5t），以及外源性的七肽活性分子deltorphin I（5u），均有良好的反应活性。

图3. 多肽底物拓展。图片来源：J. Am. Chem. Soc.

在良好的多肽底物兼容性基础上，作者将这一温和高效偶联策略应用于蛋白质的化学选择性修饰中。作者选择分子量为33 kDa、具有312个氨基酸残基的halotag 7作为模型蛋白，通过对其第106位的天冬氨酸羧基残基进行苯硼酸衍生化后，成功得到硼酸底物，与含生物素片段的NH-硫亚胺（1q）进行偶联，以43%的收率生成蛋白分子7，实现了对halotag 7的硫亚胺化修饰（图4）。鉴于S=N键在稳定IV型胶原蛋白结构中起到的关键作用，作者研究了在生理学条件下蛋白质中S=N键的化学稳定性。蛋白免疫印迹实验结果表明，蛋白分子7中的S=N结构在pH 7.4的PBS培养液、氧化性条件（NaIO₄、H₂O₂）中相对稳定，而对酸性条件（pH 5.0）、碱性条件（pH 10.0）、还原性条件（DTT）以及血清条件较为敏感，蛋白完好度为25%-60%。在检测的所有条件中，温度对S=N键的稳定性影响最大，在100 ℃条件下孵育10-30分钟，都会造成S=N键的较大破坏。

图4. 模型蛋白修饰。图片来源：J. Am. Chem. Soc.

为了深入理解反应机理，作者进行了相关的对照实验（图5）。避光条件下的模板反应显示，目标产物3aa的收率没有受到影响，排除了可见光对于Chan-Lam偶联反应的影响（图5a）。外加TEMPO和p-DNB也未对催化反应产生显著影响，表明游离的自由基不是反应历程中的主要中间体，但不排除存在笼状自由基的可能（图5b）。而在反应中加入竞争性的配体dtbpy或者neocuproine时，反应受到明显抑制（图5c），表明硫亚胺1a与铜的配位在整个催化循环过程中起到关键作用。

图5. 控制实验。图片来源：J. Am. Chem. Soc.

鉴于该催化反应的主要特色是在氩气惰性氛围中进行，无外加氧化剂的参与，作者推测反应的主要副产物为氢气。为了印证这一猜想，作者对密闭反应体系液面上方的气体进行气相色谱分析，成功捕捉到了氢气的信号。随后，为了考察氢气中两个氢原子的来源，作者以氘代甲醇为溶剂对模板反应生成的氢气进行了质谱检测与分析（图6e）。通过对体系中的气体进行间歇采样分析，证实了H-D气体的生成。以上结果表明，副产物氢气中的一个氢原子来自于醇类溶剂。

随后，作者与宾大的Marisa Kozlowski教授团队进行合作，对反应过程中H₂产生的可能途径进行了理论计算，并提出了两种可能的反应途径（图6c-d）。一种是自由基历程，以过渡态I为起始态，由硫亚胺产生的氢自由基通过过渡态III攫取iPrOH溶剂中的氢原子，生成H₂，但这与自由基捕获实验的结果不符。另一种是铜氢中间体历程，Cu(I)插入过渡态I中的N-H键，经三元环过渡态III生成铜氢中间体IV，铜氢中间体经过四元环过渡态VI攫取iPrOH溶剂中的氢原子，从而产生H₂，这一反应历程计算上能量可行，也与实验结果相匹配。而实验团队通过EPR与UV-Vis光谱实验研究Cu(I)的氧化状态，结果也证实硫亚胺1a可以促进Cu(I)到Cu(II)的单电子氧化过程（图6a-b）。

结合以上实验结果和理论计算，作者提出了该反应可能的机理（图6e）。CuBr首先与NH-硫亚胺发生配位，生成Cu(I)中间体A，中间体A经过内壳单电子转移过程生成含有自由基阴离子的中间体B，随后Cu(II)插入N-H键，生成三元环过渡态C，Cu(II)的插入促进了iPrOH溶剂中的O-H键均裂，生成含有Cu(III)的铜氢中间体D，经过四元环过渡态E生成过渡态F并释放出H₂。过渡态F与芳基硼酸通过转金属化生成过渡态G，后者经还原消除与配体交换生成目标产物3，Cu(III)还原为Cu(I)，完成整个催化循环。

图6.机理研究。图片来源：J. Am. Chem. Soc.

总结

贾铁争课题组报道了一种无外加氧化剂条件下，铜催化硫亚胺的脱氢Chan-Lam偶联反应，该方法具有简单的催化体系，温和的反应条件，以及良好的官能团兼容性，可以被应用于复杂多肽的功能化修饰中，并在生理条件下实现了对模型蛋白的硫亚胺生物标记。通过对照实验以及与Kozlowski课题组合作的理论计算研究，证实了NH-硫亚胺可以通过内壳单电子转移过程，促进Cu(I)到Cu(II)的氧化，可以作为传统Chan-Lam偶联方法的有效补充，避免了外加氧化剂导致的副反应的发生。

该成果于近日发表在化学旗舰杂志J. Am. Chem. Soc.上，南方科技大学化学系贾铁争助理教授和宾夕法尼亚大学化学系Marisa Kozlowski教授为论文共同通讯作者，南科大-哈工大联培博士生孟庭庭（实验部分）和宾大化学系博士生Lucille Wells（理论计算部分）为共同第一作者。南科大本科生王天信、博士生王金玉、博士后张世硕以及王杰助理教授都对该工作做出了重要贡献。此项研究得到了粤深联合基金、广东省自然科学基金、深圳市诺贝尔奖科学家实验室项目、广东省催化重点实验室、南开大学元素有机化学开放基金以及美国NIH等项目的大力支持。

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面，或点此查看原文）：

Biomolecule-Compatible Dehydrogenative Chan-Lam Coupling of Free Sulfilimines

Tingting Meng, Lucille A. Wells, Tianxin Wang, Jinyu Wang, Shishuo Zhang, Jie Wang, Marisa C. Kozlowski,* and Tiezheng Jia*

J. Am. Chem. Soc., 2022, DOI: 10.1021/jacs.2c04627

南方科技大学贾铁争课题组简介

贾铁争博士，课题组组长、博士生导师，2000-2003年本科毕业于中国海洋大学药学专业，获得医学学士学位。2003-2006年硕士毕业于中国海洋大学药物化学专业，获得医学硕士学位，导师：顾谦群教授，朱伟明教授，研究方向：海藻真菌活性次级代谢产物研究。2012-2015年博士毕业于宾夕法尼亚大学（University of Pennsylvania）化学系，获得有机化学博士学位，导师：Patrick Walsh教授，研究方向：钯催化亚砜C-C键和C-S键构建的新方法。2015-2017年在加州理工学院（California Institute of Technology, Caltech）从事博士后研究，研究方向为DNA化学生物学，导师：Peter B. Dervan院士。自2017年底加入南方科技大学化学系，任助理教授/实验室PI。以第一作者和通讯作者身份，在JACS, ANIE等国际顶尖化学期刊上，发表论文20余篇。

课题组招聘有机化学和药物化学背景的博士后2名，有多肽合成或者药物活性筛选经验者优先。每年招收博士1名，硕士1名，有意者请直接发邮件申请，联系方式：jiatz@sustech.edu.cn。

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