液滴微流控-荧光成像平台分析单细胞的外泌因子

单细胞分析技术是了解和认识细胞异质性的主要工具。尽管单细胞分析技术最近取得了进展，但用于跟踪单细胞外泌因子的能力仍然有限。近日，吉林大学超分子结构与材料国家重点实验室的徐抒平团队与吉林大学第一医院泌尿外科王伟刚教授、吉林大学药学院梁重阳教授合作开发了一个分析单细胞外泌因子（VEGF）的平台。该平台集成了微流控液滴与荧光成像技术，通过在靶细胞表面构建三明治免疫结构，从而将外泌因子富集在靶细胞表面，解决了以往研究中将单细胞和传感报告元件（如磁珠、报告细胞）同时封装在一个液滴中的操控难题，提高了液滴的有效性（图1c）。

图1. (a) 两种类型的免疫颗粒制备过程示意图。(b) 用生物素（Sulfo-NHS-LC-Biotin）和链霉亲和素处理细胞。(c) 基于微流控液滴封装单细胞和单个细胞分泌的VEGF荧光成像分析的工作流程图。

该方案是在细胞膜表面上构筑免疫三明治夹心结构。首先，用生物素（Sulfo-NHS-LC-Biotin）和链霉亲和素（Strepavidin）在细胞膜表面进行预处理（图1b），其中Sulfo-NHS-LC-Biotin能够实现对细胞膜蛋白的高效生物素化。此外，该处理的细胞表面由于存在带电的磺基基团，使细胞膜对纳米粒子的透过性降低，减少了纳米探针内化的可能。本研究主要制备了两种免疫纳米探针（图1a）。一种是双功能的可靶向细胞膜蛋白并捕获细胞因子（VEGF）的无色二氧化硅纳米粒子（SiO₂@Biotin-Ab/mAb_VEGF, 图1a），即捕获探针。另一种是用VEGF多克隆抗体修饰的染料{三(2,2′-联吡啶基)钌(II)，[Ru(bpy)₃]²⁺}掺杂的二氧化硅纳米粒子（F-SiO₂@pAb_VEGF, 图1a），其中[Ru(bpy)₃]²⁺负责输出荧光信号，即报告探针。通过细胞外泌的VEGF作为桥梁在细胞膜表面构建免疫三明治结构，用来追踪每个细胞的荧光成像来确定其分泌VEGF的含量（图1c）。利用这个检测原理，首先利用荧光激活的流式成像细胞仪检测了不同细胞群体分泌的VEGF含量（图2），证实了三种细胞群体（MCF-7、HeLa、H8）分泌VEGF存在差异。为了更好地揭示细胞间的异质性，该研究进一步利用微流控液滴技术将单细胞与两种探针分隔在单液滴内，对液滴阵列进行荧光成像和成像分析，进而在单细胞水平上评价了三种细胞系分泌VEGF的能力（图3）。结果显示癌细胞分泌的VEGF明显高于正常细胞，癌细胞分泌VEGF的异质性也比正常细胞更明显。

图2. 荧光激活成像-流式细胞术高通量分析不同群体细胞分泌的VEGF。

图3. 微流控液滴-荧光成像分析不同细胞系单个细胞分泌的VEGF。

该工作主要在5个方面体现了优势和创新性:（1）有效液滴数量提高。使用微液滴封装单个细胞效率复合泊松分布（约为20%）。如若在微液滴中同时封装单个细胞和报告元件（额外细胞或微珠）的概率将大大下降。本方法是在感兴趣的细胞表面实现三明治检测策略，无需额外报告载体，这使得有效的液滴和细胞数量大大提高。（2）一种基于成像的单细胞分析方法。由于宽视场成像可以避免光谱点测量的随机性误差，比逐点测量更精确，提高了结果的可靠性。（3）这一传感策略是将分散在均匀溶液中的纳米报告探针富集于生物膜界面上，具有更高的灵敏度，可满足单细胞分析的高要求。（4）该方法使用的细胞表面的偶联策略因电荷的引入削弱了细胞膜的透过性，减小了纳米探针内化的可能，确保成像信号贡献来自细胞外泌的VEGF，而非细胞内的VEGF。（5）该技术使得根据细胞外泌VEGF水平进行实时细胞区分成为可能。该方法有望成为高通量分析单细胞外泌因子的细胞异质性的有力工具。该技术未来有望应用于泌尿系统移行细胞癌的早期诊断中。

这一成果近期发表在美国化学会杂志Analytical Chemistry 上，文章的第一作者是吉林大学博士生丛丽丽，通讯作者为徐抒平教授、王伟刚教授、梁重阳教授。文章中的微流控液滴的制备、荧光流式成像及荧光共聚焦成像在吉林大学超分子结构与材料国家重点实验室完成，细胞培养是在吉林大学分子酶学工程教育部重点实验室施维教授课题组完成。该工作受国家自然科学基金（21873039），应用光学国家重点实验室开放项目（SKLAO2021001A14）、吉林大学交叉融合创新项目（JLUXKJC2020106）、吉林省健康科技创新项目（2019J020）和吉林省科技发展项目（20200403077SF和202104099YY）资助。

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Single-Cell VEGF Analysis by Fluorescence Imaging–Microfluidic Droplet Platform: An Immunosandwich Strategy on the Cell Surface

Lili Cong, Yu Tian, Zepeng Huo, Weiqing Xu, Chunxi Hou, Wei Shi, Weigang Wang*, Chongyang Liang*, and Shuping Xu*

Anal. Chem., 2022, DOI: 10.1021/acs.analchem.2c00695

导师介绍

徐抒平

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