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Nano Lett. | 华西医院应斌武: 破伤风类毒素的颜色和距离二元可视化分析

作者：X-MOL 2022-03-11

英文原题：Homogeneous Binary Visual and Fluorescence Detection of Tetanus Toxoid in Clinical Samples Based on Enzyme-Free Parallel Hybrid Chain Reaction

通讯作者：陈飘飘，应斌武，曹钰；四川大学华西医院

作者：Piaopiao Chen (陈飘飘)，Yunjin Bai (白云金)，Shiyuan Tang (唐时元)，Nian Wang (王念)，Yaqin He (何雅秦), Ke Huang (黄科), Jin Huang (黄进), Binwu Ying (应斌武), Yu Cao（曹钰）

背景介绍

破伤风是一种危及生命的疾病，其主要症状是肌肉强直和痉挛、痉挛性麻痹、呼吸功能障碍和自主神经功能障碍。每年破伤风导致大约100万人死亡，平均病死率为20-30%。破伤风感染的潜伏期一般为7-8天，也可短至24小时。尽管致死率高，治疗费用高，但尚无直接检测破伤风抗原的商业试剂盒。目前的诊断测试主要依赖于使用酶联免疫吸附试验 (ELISA) 间接检测破伤风抗体，该方法不仅操作步骤繁琐，而且会受到每个感染者健康状况的严重影响。理想的诊断测试是对抗原的检测，例如，破伤风类毒素（其为一种高效外毒素，通过阻断抑制性神经递质甘氨酸和γ-氨基丁酸的释放而引起破伤风）。然而，建立这种检测方法的报道较少，这可能是由于早期临床阶段感染标本采集困难，现有临床方法敏感性不足等问题。因此，迫切需要开发一种快速、灵敏、准确的破伤风抗原检测方法，特别是可在偏远地区有效实现即时诊断。

文章亮点

近日，四川大学华西医院陈飘飘博士、应斌武教授和曹钰教授在Nano Letters上发表了一种基于三重并联杂交链式反应的破伤风类毒素的均相二维可视化和荧光分析方法。该方法简单、灵敏高、具有成本效益。基于CdTe 量子点（QD）可以区分DNA 模板化的铜纳米簇（Cu NPs）和 Cu²⁺。通过将无酶三重并联杂交链式反应（HCR）、阳离子交换反应（CER）和喷墨打印的进一步整合，获得0.25 fg/mL的检测限（LOD）。

图1. 无酶三重并联HCR和选择性CER辅助破伤风类毒素二维视觉分析示意图。

使用Cu NPs作为荧光信号，在0.1 pg/mL至10 ng/mL的浓度范围内，获得Cu NPs荧光强度与破伤风类毒素浓度的对数呈线性关系（Y = 17 log C + 13，R² = 0.993，图2D, E），达到0.03 pg/mL的LOD。当使用QDs作为荧光信号时，该方法的灵敏度进一步提高，可检测范围为1 fg/mL至1 ng/mL，LOD为0.25 fg/mL（图2F，G）。以10 fg/mL目标的相对标准偏差 (RSD) 表示的重现性为3.8% (n = 5)。在上述条件下，对各种目标浓度的溶液颜色和试纸距离进行测定和比较。当类毒素浓度增加时，观察到溶液亮度增加，可以目视识别低至10 fg/mL的类毒素（图2H）。相比之下，试纸条上的距离表现出比颜色读数更高的灵敏度，且与荧光仪方法相当，其可目视测定低至1 fg/mL的类毒素（图2I）。

图2. 破伤风类毒素检测可行性和分析性能。（A）DNA凝胶电泳图。不同条件下Cu NPs（B）和QDs（C）为信号报告时实验可行性。荧光光谱与荧光强度与破伤风类毒素的关系：Cu NPs 为信号时 (D, E)，QD 为信号时 (F, G)。使用QD作为信号时，不同类毒素浓度下溶液颜色（H）和试纸距离（I）的可视化结果。误差线源自三次重复测量。

方法的临床适用性得到了验证。45例临床破伤风阳性和15例阴性样本的类毒素检测结果见图3A。测试结果与临床IgG抗体免疫分析结果具有良好的一致性（图3B和3C）。结果表明，阳性患者血清中的破伤风类毒素浓度均高5 fg/mL，阴性患者血清中毒素浓度低于5 fg/mL。因此我们推荐以5 fg/mL为破伤风感染的临界值。该方法可监测破伤风患者的治疗效果（图3D）。同时，验证了基于距离变化测试条的临床应用性。如图3E所示，24例临床血清样本中的破伤风类毒素浓度越高，试纸上的移动距离就越短。基于距离试纸条的检测结果不仅与荧光仪读数结果一致，且同样发现阳性血清引起的移动距离短于5 fg/mL 类毒素引起的移动距离。因此，成功证实了该基于距离读取的试纸条可为临床破伤风类毒素检测提供新的POCT策略。

图3. 临床患者和健康血清样本的破伤风类毒素检测结果和诊断数据。(A) 该策略对破伤风类毒素的分析结果。(B) 临床IgG抗体试剂盒分析结果。(C) 临床抗体试剂盒和该策略临床样本方法的一致性。(D) 破伤风抗毒素注射后1-7天患者血清中血清类毒素水平的变化。(E) 24份临床血清样本中破伤风类毒素的试纸距离检测结果。

总结/展望

研究团队开发了一种简单、高灵敏、经济的临床样本中破伤风类毒素的均相荧光和二元可视化分析法。适配体与基于QDs的CER、dsDNA模板Cu NPs和三重并联HCR的集成，使得荧光仪模式下可可获得低至0.25 fg/mL的检测限，裸眼可视化轻松识别1 fg/ mL的类毒素。84例破伤风临床样本的定量结果与临床诊断高度吻合，特异性和敏感性均达到100%。基于距离试纸条的方法的临床应用性也已成功在24例临床样品中得到验证。此外，作者推荐以5 fg/mL为破伤风感染的临界值。该策略填补了市场上破伤风抗原检测试剂盒的空白，有潜力实现低成本破伤风类毒素的POCT诊断目标。

相关论文发表在Nano Letters上，四川大学华西医院陈飘飘，白云金和唐时元为文章的第一作者， 陈飘飘博士、应斌武教授和曹钰教授为通讯作者。

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