靶向赖氨酸的长效可逆共价抑制剂

近年来，可逆共价抑制剂的开发在药物化学领域中备受关注。这类抑制剂药物在与非靶向目标结合时，可以利用其可逆的反应特性，重新解离得到活性的抑制剂物种，从而最大限度地减少脱靶反应，也避免了对靶向蛋白的永久修饰，因此具有较低的毒性和副作用。得益于可逆共价抑制剂研究的发展，已有多种重要的药物得到开发，例如抗癌药物bortezomib和用于治疗镰状细胞病的药物voxelotor。

研发可逆共价抑制剂的关键在于找到和利用合适的可逆共价反应。波士顿学院高建民课题组致力于生物分子官能团可逆共价反应的研究，该课题组在过去的几年中相继报道了可逆的亚氨基硼酸酯 (iminoboronate，图1) 化学以及它在分子探针和环肽合成的应用 (Nat. Commun., 2015, 6, 6561; J. Am. Chem. Soc., 2016, 138, 2098; J. Am. Chem. Soc., 2018, 140, 6137)。相对于一般的亚胺结构，亚氨基硼酸酯具有更高的热力学稳定性，从而提高了硼酸类分子探针或抑制剂和氨基靶标分子结合的力度。近日，该团队在氨基的可逆共价反应研究中再度创新，发展了一类新型的靶向赖氨酸侧链氨基的可逆共价反应。

图1. 靶向赖氨酸氨基的两种可逆共价反应。与iminoboronate化学（左）相比，diazaborine化学（右）呈现出大幅减慢的解离速率。

这个新的可逆共价反应采用了一个设计精巧的弹头（warhead），RMR1（图1）。RMR1弹头是苯甲醛和邻氨甲基苯硼酸（AMPB）的偶联产物。如图2所示，由于N-B的配位作用，AMPB在中性水溶液中呈现封闭构象，从而硼酸可以促进RMR1与赖氨酸氨基结合生成亚胺，然后环化生成重氮硼烷水合物（diazaborine hydrate）。这个化学反应具有极好的生物相容性，且在生物体系中完全可逆。但和iminoboronate的快速解离不同，diazaborine hydrate呈现出更好的动力学稳定性 – 它在中性水溶液中的半衰期是10小时，而iminoboronate的半衰期在毫秒量级。

图2. 重氮硼烷的可逆形成机理

基于对这些氨基可逆反应的深度理解，该团队设计了一系列的金黄色葡萄球菌分选酶 (sortase) 的可逆共价抑制剂。首先，他们通过噬菌体展示技术筛选了一个sortase的环肽配体（W7）。随后，在计算建模的辅助下，他们设计合成了RMR1弹头并将其安装到环肽配体中。安装了RMR1弹头的环肽P5（图3）对sortase的抑制效率提高了13倍。更重要的是，由于RMR1和赖氨酸结合产物的动力学稳定性，P5在金黄色葡萄球菌上展现了长效的sortase抑制功能：当更换介质去除环肽P5六个小时后，sortase的活性只得到了40%的恢复，而其他没有RMR1弹头的环肽的抑制作用则在更换介质后立即消失。这些实验结果充分表明，通过调节可逆化学反应的解离速率，可以实现长效的可逆共价抑制作用。由于赖氨酸是蛋白质中最常见的氨基酸之一，期待RMR1弹头可以在可逆共价抑制剂设计中得到广泛的应用。另外，RMR1对氨基的修饰也适用于非蛋白类的含氨基的生物分子研究中。

图3. Sortase可逆共价抑制剂的设计（左，中） 和功效研究 （右）。装有RMR1弹头的环肽P5在更换介质（模拟体内的药物清除）6小时后依然表现出显著的抑制效果。

上述成果近期发表在J. Am. Chem. Soc.上，通讯作者为美国波士顿学院高建民教授。

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Lysine-Targeting Reversible Covalent Inhibitors with Long Residence Time

Rahi M. Reja, Wenjian Wang, Yuhan Lyu, Fredrik Haeffner, and Jianmin Gao*

J. Am. Chem. Soc., 2022, 144, 1152–1157, DOI: 10.1021/jacs.1c12702