Angew. Chem.：利用天然类囊体膜高效驱动体外生物催化合成PHB

体外多酶催化，是近年来合成生物学新兴的一种生物合成技术，被广泛应用于材料、医药、食品和农业等领域。然而，体外多酶催化经常需要辅因子（如ATP和NADPH）参与，而天然辅因子的稳定性、成本、以及与多酶间的适配性，会制约整个催化系统的性能。传统的解决方法主要是构建基于酶催化的辅因子再生模块，但该方法需要引入新的酶和共底物，或者利用体系自身的底物提供辅因子再生的能量，会降低催化系统的原子经济性。通过电催化、光催化或人工脂质体的方法可以分别再生NADPH或ATP，却无法实现NADPH和ATP的共再生，对于一些同时需要这两种辅因子的系统就无法使用。天然类囊体膜，作为天然的能量转化模块，具有光能转化效率高、ATP和NADPH共再生能力强、电子传递效率高等优点，是非常理想的可用以解决体外多酶催化系统中NADPH和ATP能量供应及共再生问题的“绿色引擎”。

近日，中科院天津工业生物所朱之光研究员（点击查看介绍）团队以乙酸钠到聚3-羟基丁酸酯 (PHB) 的体外合成为例，基于植物类囊体膜天然且高效的光合作用机制，引入来自菠菜的类囊体膜，通过光能驱动类囊体膜同时空共再生NADPH和ATP，并耦联一条五酶级联催化产PHB的途径，成功构建了一个光能利用与物质转化高效协同的体外多酶催化系统（图1）。

图1. 利用天然类囊体膜驱动体外多酶催化乙酸钠合成PHB

在设计上，为了能够与天然类囊体膜进行辅因子/能量耦合利用，作者挖掘了NADPH-依耐型PhaB和ATP-依耐型ACS，并引入PAP酶，实现整个系统的NADPH和ATP再生循环利用。该研究工作中，由于植物类囊体膜是一个相对独立且复杂的光反应系统，因此，作者单独对其进行了光反应活性优化（图2）。通过优化后，反应动力学证明，在50 μmol photon m^-2 s^-1光照下，同时添加5 μM外源Fdx，可获得最佳NADPH和ATP光再生速率。

图2. 天然类囊体膜光化学反应优化

接下来，作者将PHB合成系统与优化后的类囊体膜系统进行体外耦联，获得基于乙酸钠的PHB碳摩尔转化效率为56%。为了进一步提高此效率，作者通过对整个系统的热力学和反应动力学进行分析后主要从两方面来解决这个问题：（1）组分优化并进行系统适配；（2）提高类囊体膜光反应活性的稳定性。作者通过采用固定底物浓度，控制单一变量进行逐步优化的方法，通过重点优化反应体系中的类囊体膜添加量、辅因子（NADP⁺和AMP）浓度、CoA浓度、酶添加比例等条件，实现类囊体膜与 PHB 合成体系的高效适配。同时，作者在研究过程中还发现，添加甜菜碱后，可以大大增加类囊体膜的光反应活性稳定性，但是超过0.5 M会明显降低PHB的产量。

通过优化后的光驱动PHB体外合成系统，当以10 mM乙酸钠为底物时，碳摩尔转化效率达到了86%，光能转化率达到了3.27%（图3A），而当整个体系组分同时扩大5倍后，以 50 mM乙酸钠为原料能够合成20 mM PHB，碳摩尔转化率还能达80.0%，光能转化效率达3.04% （图3B）。该光能转化效率已经远远高于自然界植物的光能转化效率（~1%），这说明，将类囊体膜作为驱动酶级联反应的绿色引擎的策略，将为体外生物制造提供一个非常有前景的选择。

图3. 优化条件下不同时间点地PHB产生和乙酸钠消耗

该研究工作提出的将天然类囊体膜作为绿色能量驱动引擎驱动体外多酶催化途径，既实现了光能利用与物质转换的良好时空耦合，为PHB的合成提供了一条可行的合成策略，也为更多体外合成生物系统的构建提供了新思路。

这一成果近期发表在Angewandte Chemie International Edition 上，天津工业生物所博士后李飞为论文第一作者，朱之光研究员为论文通讯作者。该研究获得了天津市合成生物技术创新能力提升行动和特别博士后项目的资助支持。

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面，或点此查看原文）：

Installing a green engine to drive an enzyme cascade: a light-powered in vitro biosystem for poly(3-hydroxybutyrate) synthesis

Fei Li, Xinlei Wei, Lin Zhang, Cheng Liu, Chun You, Zhiguang Zhu

Angew. Chem. Int. Ed., 2021, DOI: 10.1002/anie.202111054

导师介绍

朱之光

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