招募KEAP1实现目标蛋白质高选择性靶向降解

蛋白质水解靶向嵌合体（PROTAC）技术如今正受到药物研发领域的极大关注。其原理是利用小分子劫持细胞内的E3泛素连接酶和泛素-蛋白酶体系统（UPS），介导靶标蛋白的降解。相对于小分子抑制剂，PROTAC技术有很多特有的优势，如可以降解所谓“不可成药”的蛋白靶点（例如某些转录因子、骨架蛋白等），具有催化活性等。迄今为止，在已发现的将近600种人类E3连接酶中，只有很少的几种被用于PROTAC的开发，其中应用最为广泛的是CRBN和VHL。由于PROTAC技术高度依赖于E3连接酶，当所劫持的E3连接酶表达水平很低时，靶标蛋白不能被有效降解。因此，丰富可使用的E3连接酶，尤其是发展肿瘤细胞中表达水平较高的E3连接酶，将会极大促进该领域的发展。

西奈山伊坎医学院的金坚教授（点击查看介绍）课题组长期致力于开发新型PROTAC技术，以及推进这些技术的临床应用。最近，他们通过招募KEAP1蛋白实现了BRD系列蛋白的选择性降解，丰富了PROTAC技术可选择的E3连接酶，拓展了靶向蛋白降解的工具箱。

KEAP1是cullin 3 E3连接酶复合物的重要组成部分，在生物体内起着调控Nrf2蛋白水平的作用。通常情况下，KEAP1和cullin 3骨架蛋白、RBX1蛋白结合成复合物，随后结合Nrf2蛋白并介导其泛素化，最后使其降解。值得注意的是，KEAP1的表达水平在人类肿瘤细胞中非常高，特别是人肺腺癌、肾透明细胞癌、浸润性乳腺癌、前列腺腺癌、胶质母细胞瘤等恶性肿瘤细胞。因此，招募KEAP1蛋白实现关键靶点的降解成为治疗这些恶性肿瘤的一种潜在策略。

此前虽有几例关于利用KEAP1的PROTAC报道，但这些PROTAC分子细胞吸收性和药物动力学性质不佳，并且对于靶标蛋白的选择性不好，因此很难作为通用方法构建PROTAC分子。在本项研究中，作者利用前人报道的KEAP1高选择性非共价配体KEAP1-L发展了一种招募KEAP1构建PROTAC的通用方法，他们构建的PROTAC分子MS83可以选择性降解BRD4和BRD3，对其他含有溴结构域的蛋白如BRD1、2、7、8、9不起作用。

图1. 本项研究构建的PROTAC分子MS83和阴性对照组MS83N1的分子结构

KEAP1-L和KEAP1的共结晶结构清晰显示，其占据了Nrf2的结合位点，分子中的羧基包埋在KEAP1蛋白中，与氨基酸残基有关键性相互作用。同时，分子中的甲氧基溶剂可及，且很适合接上构建PROTAC所需要的连接链。在另一方面，作为一项概念性研究，作者选择已被广泛用于构建各种PROTAC的BET抑制剂(+)-JQ1，期望利用KEAP1构建BRD4的降解剂。基于以上设想，作者将KEAP1-L和(+)-JQ1用连接链连接起来，构建了PROTAC分子MS83及其前药MS83A。将KEAP1-L分子中的酯基改为酮羰基，构建了阴性对照分子MS83N1（图1）。

图2. MS83和MS83A对BRD4和BRD3的选择性降解

图3. KEAP1 介导MS83对BRD4的降解

使用三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-468来检测MS83、MS83A及基于CRBN的BRD4降解剂dBET1对BRD系列蛋白的降解效果（图2）。12小时后，MS83A和dBET1显著地降解了BRD4蛋白，然而在36小时之后，dBET1处理的细胞BRD4蛋白水平明显恢复，尤其是BRD4(L)恢复至处理前水平；MS83A对BRD4的降解作用可以持续更长时间，72小时之后蛋白水平都没有明显上升。MS83则显示了对BRD4更缓慢的降解，但是相对于MS83A的高浓度，MS83在低浓度时即显示出对BRD4有效的降解作用，且降解效果也能持续72小时。与之对应，MS83N1不能降解BRD4蛋白。进一步的生化实验表明，MS83对其降解是通过招募KEAP1蛋白实现的（图3）。

图4. 定量蛋白质组学研究表明MS83选择性地降解BRD4和BRD3蛋白

作者通过基于质谱的定量蛋白质组学实验证明，MS83在一系列BRD蛋白家族中可以选择性地降解BRD4和BRD3，其他BRD蛋白没有受到影响（图4）。

图5. MS83对三阴性乳腺癌细胞增殖抑制效果

为了进一步验证MS83对癌细胞的抑制效果，作者考察了其对两种三阴性乳腺癌细胞的增殖抑制作用。在本项目研究的降解剂和抑制剂中，小分子抑制剂JQ1因其更好的透膜效果而显示出对两种癌细胞最好的抑制效果。但是值得指出的是，MS83显示出远好于dBET1及MS83N1的抑制效果。同时，KEAP1-L-OEt没有显示出对肿瘤细胞的增殖抑制，表明MS83的抑癌作用并不是因为对KEAP1蛋白的抑制而引起的。

综上所述，作者实现了通过特异地招募KEAP1蛋白对BRD系列蛋白的选择性降解。该研究为将来使用KEAP1这一广泛高表达于癌细胞中的E3连接酶来实现对不同靶蛋白的降解打造了很好的基础。这一成果近期发表在J. Am. Chem. Soc.上，共同第一作者为魏杰丽博士和孟繁烨博士。

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面，或点此查看原文）：

Harnessing the E3 Ligase KEAP1 for Targeted Protein Degradation

Jieli Wei, Fanye Meng, Kwang-Su Park, Hyerin Yim, Julia Velez, Prashasti Kumar, Li Wang, Ling Xie, He Chen, Yudao Shen, Emily Teichman, Dongxu Li, Gang Greg Wang, Xian Chen, H. Ümit Kaniskan*, and Jian Jin*

J. Am. Chem. Soc., 2021, 143, 15073–15083, DOI: 10.1021/jacs.1c04841

金坚教授简介

金坚，著名药物化学家, 美国西奈山医学院冠名教授，西奈山医疗发展中心主任, 西奈山伊坎医学院药理学系、肿瘤和神经科学系、帝势癌症研究所终身教授。本科毕业于中国科学技术大学；博士毕业于宾夕法尼亚州立大学，师从著名有机化学家Steven M. Weinreb。

金坚教授具有二十多年的小分子药物研发经验，在国际药物化学界享有盛誉。曾任葛兰素史克（GlaxoSmithKline）公司药物化学部门总监、北卡罗来纳大学教堂山分校药物化学部副主任等职。金坚教授课题组的研究方向主要为：（1）组蛋白甲基转移酶选择性抑制剂的发现；（2）G蛋白偶联受体偏向性配体的开发；（3）靶向肿瘤蛋白新型降解剂的研制。迄今为止已在相关领域发表近200篇SCI论文，包括Nature, Science, Cell, Nat. Med., Nat. Rev. Drug Discov., Nat. Biotechnology, Nat. Chem. Biol., Nat. Reviews Cancer, Cancer Cell, Nat. Cancer, J. Am. Chem. Soc., Angew. Chem. Int. Ed., Sci. Adv., Nat. Commun., J. Med. Chem.等；申请美国及国际专利60余项。

金坚

https://www.x-mol.com/university/faculty/311500 

课题组主页:

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