JACS：联烯酮介导的不消旋酰胺键形成反应及其在多肽合成中的应用

酰胺键是一种广泛存在于自然界的基本官能团。据统计，约四分之一的上市药物与三分之二的候选药物含有酰胺键。酰胺键的形成是药物合成化学中应用最广泛的有机化学反应。因此，酰胺键的形成成为科学家广泛关注的一个研究领域。经过一个多世纪的发展，已经有近百种酰胺键形成方法被发展出来。但是，由于这些方法的手性原料难以获得，因此其能够用于合成α-手性酰胺的方法非常有限，能够用于多肽合成的方法则更少。目前应用最广泛、最可靠的多肽合成方法还是天然α-氨基酸在缩合剂作用下脱水缩合。但是传统缩合剂在用于肽键的构建时，由于其对α-氨基酸羧基的过度活化而经常会诱发α-位手性中心的外消旋化和其它副反应。另外，虽然多肽合成已实现了自动化，但其原子经济性极差，导致产生大量化学废物、多肽生产成本高昂等问题。但固相多肽合成已经达到了其技术瓶颈，只能通过原始创新的肽键形成方法才有望解决多肽合成中的这些问题。因此，随着多肽在药物、材料、化妆品等精细化学品中日益重要的应用，绿色高效的多肽合成方法逐渐成为该领域亟待解决的关键科学问题。

赵军锋（点击查看介绍）课题组致力于通过发展有机化学新试剂和新反应来解决多肽与蛋白质化学合成与修饰中的关键科学问题。2016年，他们首次发现炔酰胺可以用作不消旋的多肽缩合剂（J. Am. Chem. Soc., 2016, 138, 13135），利用炔酰胺类缩合剂他们还发展了一种在多肽主链骨架上精准引入硫代酰胺键的方法（Angew. Chem. Int. Ed., 2019, 58, 1382，J. Org. Chem., 2020, 85, 1484.）。同时他们还发现炔酰胺类缩合剂还能够用于分子间酯化反应（J. Org. Chem., 2020, 85, 6188）与大环内酯化反应（ACS Catal., 2020, 10, 5230.）中，表明炔酰胺是一类广谱高效的缩合试剂。最近，他们在不消旋构建酰胺键领域又取得新进展，他们发现联烯酮也可以作为缩合剂用于酰胺键的不消旋构建，并成功将该方法用于多肽合成。

图1. 含sp杂化中心碳原子缩合试剂的设计

通过对以往缩合试剂分子结构的认真分析，作者发现它们有一个共同的特点就是这些分子都含有一个sp杂化中心碳原子（图1）。因此，作者提出了从同样含有sp杂化中心碳原子的联烯衍生物中开发缩合剂的想法。由于联烯衍生物与羧酸反应生成的烯基酯中间体不含有碱性基团，有望避免其它含碱性基团的缩合剂造成的α-碳手性中心外消旋化的风险。经过初步的研究，作者发现联烯酮有望作为潜在的联烯衍生物缩合试剂。接下来，作者对联烯酮介导的酰胺键形成反应进行了系统深入的研究。他们发现室温条件下苯基联烯酮2a与苯甲酸即可进行反应并以95%的收率生成α-羰基烯基酯3a（图2式1）。而α-羰基烯基酯3a能在室温DMF中与2-苯乙胺快速发生氨解反应，以几乎定量的收率得到酰胺4a（图2式2）。这两步反应均可自发进行，反应过程中不需要任何额外的添加剂或催化剂（图2）。值得注意的是上世纪60年代科学家曾提出烯基酯不适合于酰胺和多肽合成，这是因为烯基酯的羰基副产物会与氨基组分的氨基发生直接脱水生成亚胺。幸运的是，本文中的亚胺副反应速度非常慢，不会对主产物的收率造成影响（图2式3）。

图2. 联烯酮介导的两步法酰胺键构建策略

在获得了最优的反应体系后，作者首先对联烯酮介导的酰胺形成反应进行了底物拓展。如图3所示，各类烷基、芳基和α,β-不饱和羧酸都能与联烯酮2a发生1,4-加成/异构化反应，以近乎定量的收率获得相应的α-羰基烯基酯。由于其收率和纯度都很高，因此该活性中间体可不经纯化直接用于氨解反应，实现了“两步一锅”法合成酰胺。对于那些位阻大的底物以及亲核性弱的胺，该策略也能很好的兼容，以优秀的收率获得相应产物。作者还发现10%的HOBt催化剂可显著提高那些困难底物的反应速率（图3）。

图3. 联烯酮介导的酰胺键形成方法

初步证明了联烯酮是一类有效的酰胺缩合剂后，作者尝试将该策略用于更具挑战性的肽键的构建。作者先考察了N-保护α-氨基酸与联烯酮缩合剂的反应效率，如图4所示，20种天然α-氨基酸和各种非天然氨基酸都可与联烯酮2a进行高效的1,4-加成/异构化反应（活化过程）。除了组氨酸以外，都能以定量的收率获得相应的α-羰基烯基酯。大位阻的氨基酸也能够很好的反应，同时羟基、伯酰胺、色胺等活泼侧链官能团和Fmoc、Cbz、Boc等保护基都可兼容。这些氨基酸的活化酯都是稳定的固体，易于纯化和保存。然后作者考察了这些氨基酸活化酯在二肽合成中的应用，他们发现天然氨基酸的α-羰基烯基酯都可以顺利地与α-氨基酸酯进行氨解反应，在室温下以几乎定量的收率生成相应的二肽。大位阻的天然与非天然氨基酸都可以作为羧酸组分或氨基组分参与反应。当大位阻氨基酸作为羧酸组分时，需要稍长时间才能完成反应，加入10%的HOBt催化剂可大大加快反应的进行。值得说明的是，对于20种天然氨基酸，无论是在活化过程还是后续的氨解反应，都不会发生外消旋化或者差向异构化。即使对于最容易发生消旋的苯甘氨酸，也可以很好地作为酸或者胺参与反应。虽然苯甘氨酸作为酸组分在室温氨解时观察到少量的消旋，但低温下反应则可完全避免消旋。该策略用于氨解反应时，对各种侧链官能团也都有非常好的兼容性。无论是丝氨酸、苏氨酸侧链的羟基，还是天冬酰胺、谷氨酰胺侧链的伯酰胺，还有色氨酸侧链的色胺基团，都不影响肽键的形成（图4）。与普通酰胺一样，由于氨基酸活化过程的高效性，其活化酯无需纯化即可用于下一步氨解反应，因此所有二肽都可以通过“两步一锅”法进行合成，反应效果甚至优于两步法。值得一提的是，在二肽的合成过程中，仅需要1.1倍当量的氨组分即可高效完成反应。

图4. 联烯酮介导的不消旋肽键构建方法

为了进一步探索联烯酮类缩合试剂的应用范围，作者尝试将其用于多肽片段连接。与脲烷型保护基如Fmoc、Boc、Cbz等保护的单个氨基酸相比，多肽片段羧酸在活化与氨解时更易发生消旋（差向异构化）。如图5所示，联烯酮2a作为缩合试剂可顺利地与二肽、三肽和四肽羧酸发生1,4-加成/异构化反应（活化），以优秀的收率生成相应的多肽α-羰基烯基酯。这些多肽活化酯能够与另外的氨基酸酯或者多肽片段发生氨解反应实现多肽片段连接，以优异的收率获得相应的多肽产物。让作者欣慰的是，与二肽的合成类似，不论在多肽片段羧酸活化过程还是后续的氨解反应中，都无外消旋化（差向异构化）副反应发生。虽然肽链增长之后活化所需时间较长，但是其氨解反应仍然非常迅速，通常几分钟到几小时即可完成。在多肽片段连接中，仅需1.1倍当量的氨组分多肽即可高效完成反应，连接位点并不局限于某些特定氨基酸。该策略操作简单，原子经济性高，连接位点广谱且不发生差向异构化，为长链多肽药物的合成提供了一种极富吸引力的汇聚式合成方法（图5）。

图5 联烯酮介导的多肽片段连接

联烯酮类缩合剂的优势在多肽药物卡非佐米的化学全合成中表现的淋漓尽致。卡非佐米是美国FDA于2012年批准的一款治疗多发性骨髓瘤的特效多肽药物，其2020年全球销售额为16.5亿美元。该多肽药物中C端的环氧基团在常规的多肽合成条件下（氨基酸缩合与脱保护）都不稳定，该片段必须要在合成的后期引入，因此传统的C端向N端多肽合成方法不利于该药物的合成。相反，沿N端向C端的反向肽链延伸方式是解决卡非佐米合成问题的理想策略。但是该策略涉及到多肽羧酸的反复活化与缩合，常规缩合剂都会诱发比较严重的消旋，不但增加了纯化的难度，而且降低了目标产物的收率，因此文献报道总收率都非常低（26-36%）。作者发现联烯酮2a是合成卡非佐米的理想缩合剂，通过联烯酮介导的肽键形成方法，作者成功实现了从N端到C端的卡菲佐米全合成。由于肽键形成过程中避免了消旋副反应的发生，不但纯化方便，而且主产物收率得到了提高，因此总产率（68%）相较于传统方法（26-38%）得到了极大的提升（图6）。

图6 联烯酮介导的卡非佐米全合成

在固相多肽合成技术发明之前，活化酯氨解策略一直是合成多肽的有效方法。活化酯的结构明确、活性适中、反应机理简单，能够有效避免外消旋化与其它副反应的发生，但不足之处是氨解反应时间太长（几天到两周）。另外，活化酯需要预先合成，大多都需要用到化学计量的缩合试剂、羟基亲核试剂乃至消旋抑制剂。在操作与原子经济性层面上与缩合剂法相比并无优势，因此随着缩合试剂与固相多肽合成的发展，活化酯法逐步淡出了多肽合成领域。如果能够解决活化酯的低活性和难合成的问题，活化酯法将有望解决当前缩合剂法在固相多肽合成中的消旋与其它副反应的问题。与传统活化酯相比，联烯酮与氨基酸形成的活化酯具有易合成、活性高、原子经济性好和反应条件温和等优点，同时肽键形成过程中不会发生外消旋化。因此，联烯酮活化酯法兼具了传统活化酯法与缩合剂法的优点而避免了其缺点，有望用于固相多肽合成。为了考察α-羰基烯基酯在固相多肽合成中应用的可行性，作者选取经典困难十肽ACP(65-74)为模型。作者发现在固相载体上仅需两倍当量的α-羰基烯基酯即可定量不消旋地完成肽键的构建，无需外加消旋抑制剂和碱性添加剂，反应一般在1-2小时完成。外加10%的HOBt催化剂可显著提高反应速率，使大部分氨基酸的缩合反应在20-30分钟内即可完成，而大位阻氨基酸也能在2小时内完成缩合。作者通过反复的9次缩合与脱保护循环，最终获得了纯度为98%的困难十肽ACP(65-74)粗产物。作者同时也与经典固相多肽合成方法进行了对比，当用PyBOP与HBTU作为缩合剂时，分别获得了86%和77%粗肽产物。而当以氨基酸的五氟苯酚酯为活化酯时，粗肽纯度仅为60%。与传统固相多肽合成方法相比，联烯酮活化酯法展现出了显著的优越性。另外，作者还发现氨基酸的α-羰基烯基酯的DMF溶液在室温下可以保存十天而不变质，因此该方法有望用于多肽的自动合成。

图7. α-羰基烯基酯作为砌块的困难十肽ACP(65-74)的固相合成

图8 不同缩合方法在多肽固相合成中合成困难多肽ACP(65-74)的对比

总结

赵军锋教授课题组发展了一种联烯酮介导的不消旋酰胺键形成方法，并成功将该方法用于多肽合成。该策略无需额外的催化剂和添加剂即可在温和的条件下高效完成氨基酸的活化及活性中间体的氨解，以几乎定量的收率获得目标酰胺。由于反应过程中不会发生外消旋化或差向异构化，因此该方法不仅可以用于普通酰胺及二肽的合成，也可用于多肽片段连接及多肽固相合成，对于20种天然α-氨基酸及其它非天然氨基酸都有很好的适应性。氨基保护的α-氨基酸在室温敞口容器中即可自发与联烯酮发生加成反应定量生成α-羰基烯基酯中间体，此类烯基活化酯制备简捷、高效，且无需额外的羟基亲核试剂。20种天然氨基酸的活化酯都是稳定的固体，可在冰箱中存放12个月以上不变质。活化酯后续的氨解反应也是在室温敞口容器中进行，无需其它添加剂，反应迅速（大部分酰胺可在1小时内完成）。烯基酯优良的反应活性不但避免了外消旋化的发生，而且降低了其它副反应发生的风险。因此该策略整合了传统缩合试剂的高活性及活化酯策略不消旋的优点，并且克服了二者的缺点。联烯酮缩合剂的成功开发为多肽缩合试剂的设计提供了新思路，开辟了多肽合成新途径。该工作不但具有重要的学术价值，而且具有广阔的应用前景。

由于20种天然氨基酸的活化酯易于合成，且都为稳定的固体，易于纯化和保存，都可直接用于固相多肽合成。与传统固相多肽合成每步缩合需要氨基酸、缩合剂、消旋抑制剂和碱性添加剂等四种试剂相比，该方法只需要活化酯一种试剂即可（10%的HOBt可显著缩短反应时间），极大地简化了固相多肽合成的试剂配方，展现出了显著的优越性。作者正在推动20种天然氨基酸α-羰基烯基酯的商业化，这样用户可直接采购氨基酸的活化酯进行多肽合成。简化的试剂配方使多肽合成更加便捷，同时大幅度减少了肽键形成时化学废物的产生，实现了节能减排，降低了多肽的生产成本。因此，联烯酮介导的不消旋肽键形成策略将有望成为多肽合成工业的一项变革性技术。

相关研究工作发表在J. Am. Chem. Soc.上，该工作得到了国家自然科学基金重大研究计划、面上项目和南开大学元素有机化学国家重点实验室开放基金的支持。

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面，或点此查看原文）：

Allenone-Mediated Racemization/Epimerization-Free Peptide Bond Formation and Its Application in Peptide Synthesis

Zhengning Wang, Xuewei Wang, Penghui Wang, and Junfeng Zhao*

J. Am. Chem. Soc., 2021, 143, 10374-10381, DOI: 10.1021/jacs.1c04614

赵军锋教授课题组网页链接：

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