Anal. Chem.：力学微环境对心肌成纤维细胞氧化还原状态影响的单细胞电化学研究

心肌成纤维细胞分化为肌成纤维细胞是心肌纤维化的主要病理特征之一，该过程诱导细胞外基质（如I型胶原）持续性分泌，显著改变心肌的力学微环境（基质硬度增加），进一步促进心肌成纤维细胞分化。心肌成纤维细胞的氧化还原状态异常是其病理状态指标之一，谷胱甘肽（GSH）作为重要的氧化还原物质，GSH与其氧化态（GSSG）的比率（GSH/GSSG）常被作为表征细胞氧化还原状态指标。另外，为避免相邻细胞对心肌成纤维细胞氧化还原状态的干扰，需要在单细胞水平上对心肌成纤维细胞的GSH水平进行原位表征。因此，从单细胞水平研究细胞外基质硬度对心肌成纤维细胞GSH含量的影响对理解心肌纤维化具有重要意义。扫描电化学显微镜（scanning electrochemical microscopy，SECM）作为一种微区电化学表征技术，可在单细胞水平上对活细胞消耗或释放的化学小分子进行高时空分辨、原位和无标记检测，可作为原位表征心肌成纤维细胞GSH变化的理想工具。

近日，西安交通大学生命科学与技术学院仿生工程与生物力学研究所（BEBC）李菲（点击查看介绍）课题组基于水凝胶材料构建了心肌成纤维细胞的力学微环境体外模型，结合SECM技术研究了基底硬度对心肌成纤维细胞氧化还原状态指标GSH含量的影响（图1）。

图1. 应用SECM研究不同基质硬度水凝胶上培养心肌成纤维细胞GSH含量的示意图

该工作首先通过调控水凝胶（聚丙烯酰胺（PA））硬度（7.4、22.7、97.0 kPa）模拟正常和纤维化的心肌基质，并将心肌成纤维细胞接种到水凝胶表面并培养不同时间，构建了心肌成纤维细胞体外力学微环境模型。之后，分别以[Ru(NH₃)₆]Cl₃和FcCOOH 为氧化/还原电对，对22.7 kPa PA水凝胶上培养的心肌成纤维细胞进行了SECM成像，并通过有限元模拟得到了心肌成纤维细胞释放GSH的表观速率常数k。实验结果证实，[Ru(NH₃)₆]Cl₃电对可用于SECM实验中心肌成纤维细胞的形貌和定位，FcCOOH电对可被用于检测心肌成纤维细胞外排的GSH含量（图2）。

图2. 分别以[Ru(NH₃)₆]Cl₃和FcCOOH 为氧化/还原电对，应用SECM对22.7 kPa PA水凝胶上培养3天心肌成纤维细胞的成像和渐进曲线结果

为探究基质硬度对心肌成纤维细胞氧化还原状态的影响，应用SECM结合三维深度扫描模式（depth scan mode），对在不同基质硬度PA水凝胶上培养不同天数的心肌成纤维细胞的外排GSH过程进行了表征，并结合有限元模型模拟得到了心肌成纤维细胞释放GSH的表观速率常数k值（图3）。 

图3. 以FcCOOH为氧化还原电对，应用SECM对不同培养天数、不同基质硬度PA水凝胶上培养的心肌成纤维细胞的（A）深度模式扫描图和（B-E）渐进曲线模拟结果图。

通过比较不同基质硬度上心肌成纤维细胞释放GSH的表观速率常数k值，证实不同纤维化程度体外力学微环境中心肌成纤维细胞的氧化还原状态存在明显差异（图4）：软基质上培养的心肌成纤维细胞k值明显高于硬基质的k值，表面随基质硬度增加，心肌成纤维细胞释放的GSH呈下降趋势。证实在心肌成纤维细胞向肌成纤维细胞分化过程中，其氧化还原微环境可能偏向氧化态。由于心肌成纤维细胞GSH的耗竭可能是纤维化发生的早期事件，该工作提出可尝试根据k的变化来判断心肌成纤维细胞的纤维化程度，采取针对性的解决方案来维持细胞氧化还原平衡，从而避免细胞陷于纤维化的病理状态新思路。

图4. 不同培养天数、不同基底硬度PA水凝胶上培养心肌成纤维细胞释放的GSH与[FcCOOH]⁺反应表观速率常数k的变化结果图

该研究成果发表在美国化学会杂志Analytical Chemistry 上。该文章共同第一作者是西安交通大学硕士生郎瑾新和博士生李亚北，通讯作者为西安交通大学李菲教授。该文章的其他作者还包括西安交通大学研究生叶朝阳、杨耀维、徐峰教授和武汉大学黄国友副教授等。该工作得到加拿大西安大略大学丁志峰教授和美国哈佛仪器公司Frank Wang博士以及西安交通大学化学院张军杰工程师在理论模拟和技术方面的帮助与支持，以及国家自然科学基金面上项目、陕西省杰出青年科学基金、中央高校基础科研基金等的资助。

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面，或点此查看原文）：

Investigating the Effect of Substrate Stiffness on the Redox State of Cardiac Fibroblasts Using Scanning Electrochemical Microscopy

Jinxin Lang, Yabei Li, Zhaoyang Ye, Yaowei Yang, Feng Xu, Guoyou Huang, Junjie Zhang, and Fei Li*

Anal. Chem., 2021, 93, 5797–5804, DOI: 10.1021/acs.analchem.0c05284

导师介绍

李菲

https://www.x-mol.com/university/faculty/13704 

课题组介绍

http://gr.xjtu.edu.cn/web/feili