西交大李菲课题组Anal Chem：基于手工折纸技术的三维纸基等电聚焦平台及蛋白疾病标志物检测应用

近些年，社区和家庭医疗引起越来越多关注。社区医疗的第一步为疾病的快速、现场诊断。对作为重要疾病标志物的蛋白质检测在疾病诊断中发挥着重要作用。但生理样品中蛋白质的组成非常复杂，而且很多蛋白疾病标志物含量很低使蛋白检测面临挑战。因此，在分析实际生理样品中的蛋白质时，通常需要样品前处理过程。等电聚焦是一种既可实现蛋白质分离，又可实现蛋白质富集的电泳技术。传统等电聚焦平台通常以毛细管和凝胶为基体，操作过程复杂且需要大型仪器，无法满足现场快速、便携的检测需求。近些年，以纸为基底的等电聚焦平台由于价廉和便携的特点，被应用于即时检测的蛋白质分离与富集中。但以往报道的纸基等电聚焦平台都是基于二维纸基分离通道，在实现蛋白质的分离和富集后，难以对目标蛋白进行直接检测。此外，纸基等电聚焦平台难以实现对高盐生理样品的直接预处理，而需要耗时的除盐前处理过程。因此，对实际生理样本中蛋白疾病标志物的即时检测需要一种小型化、可直接分离和富集蛋白质、且便于后续检测的等电聚焦平台。

近日，西安交通大学生命科学与技术学院仿生工程与生物力学研究所 (BEBC) 李菲课题组与陕西省人民医院中医科姜小帆博士合作开发了一种基于折纸技术的三维纸基等电聚焦平台。该平台可实现蛋白质的分离与富集，既适用于低盐生理样品，又可用于高盐生理样品（如尿液、血清），并通过与手机成像、侧流试纸等检测方法进一步结合，可实现对实际生理样品中蛋白疾病标志物的直接定量检测（图1）。

图1. 三维纸基等电聚焦平台的设计及其在蛋白分离、富集和分析中的应用示意图

该工作以醋酸纤维素膜为分离通道的基体材料，色谱纸为储液池的基体材料，以电池为电源构建了小型化的等电聚焦平台（图2a）。为构建三维纸基分离通道，首先通过激光切割技术将醋酸纤维素膜加工成二维纸基通道（图2b），接着对二维纸基通道的菱形区域疏水化处理并保持圆形区域亲水（图2c），最后通过手工折纸技术将二维纸基通道加工成三维纸基通道（图2d）。

图2. 三维纸基等电聚焦平台的实物图及分离通道构建过程图

基于传统等电聚焦体系难以直接分离、富集高盐生理样品中蛋白质的问题，该工作通过优化三维纸基等电聚焦平台中储液池内的电解质溶液（以去离子水为储液池中的电解质溶液代替传统的酸碱溶液），在高盐样本中蛋白质等电聚焦之前首先成功实现了对样本的除盐功能（图3a），之后基于优化后的三维纸基等电聚焦平台，可在12 V的电池驱动下成功完成高盐样品（0.9% NaCl）中藻蓝蛋白（Phy）、牛血红蛋白（BHb）和细胞色素C（Cyt C）的等电聚焦过程，实现分离（图3b, c）。

图3. (a) 三维纸基等电聚焦平台分离高盐样品的除盐原理图；(b) 三维纸基等电聚焦平台分离高盐样品中标准蛋白的结果图；(c) 等电聚焦后灰度强度随分离通道位置变化的曲线图。

为进一步验证该三维纸基等电聚焦平台直接分离、富集和检测生理样品中蛋白质的可行性，以临床尿液为样本，进行了其中微量白蛋白的检测。检测过程包括：直接以尿液为三维纸基等电聚焦样品，等电聚焦后将三维纸基分离通道展开，然后含有白蛋白的独立纸片被用作微反应器进行了白蛋白的比色定量检测（图4a）。基于此方法取得了对尿液中白蛋白6.19 mg/L的检出限（图4b），并成功实现了对6例临床样本中白蛋白的定量检测。应用该平台的检测结果与临床检验科检测结果对比的相对偏差小于8.4%。

图4. (a) 三维纸基等电聚焦后不同浓度白蛋白在醋酸纤维素膜上的显色结果图；(b) 白蛋白浓度和灰度强度的校准曲线；(c) 6例临床样本中白蛋白的三维纸基等电聚焦和临床检验结果对比图。

应用三维纸基等电聚焦平台分离、富集生理样品中的蛋白质后，纸上的蛋白质可通过简单的震荡操作收集到水溶液中，通过收集目标蛋白进行离线检测。整个蛋白回收过程可在5分钟内完成，回收率达到55.9%-81.3%。基于收集目标蛋白进行离线检测的方法，该三维纸基等电聚焦平台与侧流试纸进一步结合，实现了对人血清中C反应蛋白的定量检测。图5a为不同浓度C反应蛋白的侧流试纸显色结果图，基于上述结果得到对C反应蛋白0.35 mg/L的检出限（图5b）。将此方法应用于临床血清中C反应蛋白的定量检测，取得了与临床检测结果相比相对偏差小于13.1%的结果。该三维纸基等电聚焦平台作为小型化的蛋白质分析平台在现场、快速检测领域显示出应用前景。

图5. (a) 三维纸基等电聚焦后不同浓度C反应蛋白在侧流试纸上的显色结果图；(b) C反应蛋白浓度和灰度强度的校准曲线；(c) 4例临床血清样本中C反应蛋白的三维纸基等电聚焦和临床检验结果对比图。

该研究成果发表在美国化学会杂志Analytical Chemistry 上，并被选为杂志的封面文章。该文章第一作者是西安交通大学博士生牛纪成，通讯作者为西安交通大学李菲教授和陕西省人民医院姜小帆博士。该文章的其他作者还包括西安交通大学本科生包芷卉、魏子宁，斯坦福在线高中李心泽同学和唐都医院内分泌科高彬主任等。该工作得到了陕西省自然科学基金、国家高层次留学回国人才基金、中央高校基础科研基金、中国博士后科学基金、浙江省临床功能材料与诊疗器件工程技术研究中心项目和唐都医院尖子人才基金等的资助。

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面，或点此查看原文）：

A Three-Dimensional Paper-Based Isoelectric Focusing Device for Direct Analysis of Proteins in Physiological Samples

Jicheng Niu, Zhihui Bao, Zining Wei, Jasmine Xinze Li, Bin Gao, Xiaofan Jiang*, Fei Li*

Anal. Chem., 2021, DOI:10.1021/acs.analchem.0c04883

导师介绍

李菲

https://www.x-mol.com/university/faculty/13704

课题组介绍

http://gr.xjtu.edu.cn/web/feili