基于质谱足迹法的蛋白质高级结构分析：基础与应用

蛋白质作为生物活动的基础，其结构解析一直为生物学与分析化学中的热点。目前有多种方法可以解析其结构。高分辨率方法包括核磁共振谱学、蛋白质X射线晶体学以及冷冻电镜，但是其解析过程较为繁琐，样品须符合许多特殊条件。偏振荧光光谱、傅里叶变换红外、圆二色光谱等方法具有快速检测以及高通量的优势，但是能给出的信息存在很大的局限性。质谱学（mass spectrometry）方法拥有样品量需求低、高通量、可提供中高分辨率信息等优点，近年来在蛋白质高级结构解析领域起着越来越重要的作用。

足迹法（footprinting）利用化学试剂对蛋白质的溶剂可及表面（solvent accessible surface）进行标记，在通过质谱检测与定量分析之后得出蛋白质的高级结构。标记方法主要分为可逆的氢氘交换（hydrogen deuterium exchange）与不可逆的共价标记。本文详细的介绍了包括氢氘交换、蛋白质的定向试剂标记（protein labeling by targeted reagents）与蛋白质的快速自由基标记（protein labeling by fast radical species）等业界常用标记方法，共分为七个章节。

第一章详细的介绍了蛋白质的高级结构、常用的蛋白质高级结构表征方法、蛋白质质谱学的发展简史，其中包括了对离子化、检测器以及碎裂手段的历史性回顾。第二章着重介绍了利用高效液相色谱-质谱联用来追踪蛋白质的氢氘交换。氢氘交换作为最为常见的质谱学蛋白质结构解析方法，具有简单易行、容易在现有质谱设备上实现等优点。但氢氘交换可逆的特质限制了其在复杂系统中的应用，对标记后的样品处理亦有较高要求。氢氘交换的标记时间通常在秒到小时级别，因而并不适合表征离去速率较高的蛋白—蛋白相互作用。

为了克服这些缺点，不可逆的蛋白质标记方法日渐兴起。第三章详细介绍了蛋白质的定向试剂标记方法。在二十种天然氨基酸中，至少七种可作为蛋白质的定向试剂标记目标。这七种氨基酸的标记试剂以及它们在蛋白质质谱中的早期应用均有详细介绍。蛋白质的化学交联同样利用了定向试剂标记，因此也有提及。第四章则归纳了蛋白质的定向试剂标记方法在近十年来解决的主要生物问题。

定向试剂标记通常利用分子化学反应得以实现，其时间通常在分钟级别，对于一些较快的生物过程并不能很好的捕捉。第五章与第六章介绍了自由基标记试剂在蛋白质高级结构解析中的应用。在六种已有的自由基中，羟基自由基（•OH）的应用最为广泛。利用特定的羟基自由基生成方法，蛋白质的标记可以在微秒内完成。这样的标记速率使得追踪一些短暂的生物过程成为可能，例如蛋白质折叠的中间体。

在最后的章节，作者对利用质谱学方法解析蛋白质高级结构的未来做了展望。其中重要的一点是质谱学方法与先进计算机技术的结合。传统的足迹法结构解析大多依赖对比法（differential experiment），如对比有/无结合配体时的标记程度。近年来，随着计算机辅助蛋白质结构推断（computer-based structural prediction）的发展，利用足迹法的数据辅助蛋白质结构推断亦成为可能。该方向的持续发展使得蛋白质的足迹法标记不仅仅局限于对比不同的蛋白质结构状态，帮助蛋白质质谱在可预见的未来有更加广阔的应用前景。

这一综述近期发表于Chemical Reviews上，文章的共同第一作者为Washington University in St. Louis的博士生刘晓然与张梦如，博士生刘晓然与Dr. Michael L. Gross为共同通讯作者。

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Mass Spectrometry-Based Protein Footprinting for Higher-Order Structure Analysis: Fundamentals and Applications

Xiaoran Roger Liu*, Mengru Mira Zhang, Michael L. Gross*

Chem. Rev., 2020, DOI: 10.1021/acs.chemrev.9b00815

Michael L. Gross课题组简介

Michael L. Gross自1968年起在质谱领域独立开展研究工作。目前为圣路易斯华盛顿大学（Washington University in St. Louis）化学系，免疫系与药学系教授，同时担任圣路易斯华盛顿大学—美国国立卫生研究院质谱中心（NIH / NIGMS Biomedical Mass Spectrometry Resource）主任。课题组于2005年率先提出在流动系统中进行氢氧自由基的蛋白质标记（J. Am. Soc. Mass Spectom., 2005, 16, 2057-2063; Acc. Chem. Res., 2018, 51, 736-744.），目前已成为与氢氘交换同等重要的蛋白质高级结构解析方法之一。课题组近期研究方向为利用质谱学方法结合氢氘交换，蛋白质快速氧化标记，蛋白质定向试剂标记，蛋白质化学交联等化学标记方法研究蛋白质高级结构。目标问题包括蛋白质折叠（J. Am. Chem. Soc., 2012, 134, 18724-18731），蛋白质沉积（淀粉样蛋白amyloid beta，alpha synuclein等，J. Am. Chem. Soc., 2016, 138, 12090-12098），膜蛋白结构解析（Nat. Struct. Mol. Biol., 2017, 24, 69–76），配体结合亲和力测定（Anal. Chem., 2019, 91, 12560-12567），发展新型标记自由基（Free Radic. Biol. Med., 2019, 131, 126-132）等。截止2020年，课题组已经发表超过650篇，被引用超过30000余次，Dr. Gross的h-index为87。