塑料降解酶的前世今生

在地球上存在了上亿年的植物，与问世不到一百年的人造塑料之间有着什么样的关联呢？与植物相依共存的微生物演化出酶介导的系统降解生物质，为细胞生长提供所需能源，且完成生态系统中的碳循环。塑料的原料也来源于碳循环系统中的石油，我们是否能藉由生物降解的力量使塑料进入生态循环，进而减少塑料垃圾造成的污染呢？真正意义上的“吃塑料”微生物的出现又给我们带来什么启发呢？湖北大学生命科学院、省部共建生物催化与酶工程国家重点实验室的陈纯琪教授、戴隆海副教授、马立新教授（国重主任）与郭瑞庭教授共同合作，统整各种高分子生物降解机理，特别针对酶的结构特性与底物结合模式进行讨论，找寻其中的关联以及微生物因应人造物质出现的演化方向，为生物质资源的利用与塑料生物降解提供未来展望，该篇综述将发表于三月份出刊的Nature Reviews Chemistry，被选为封面文章（图1）。

图1. Nature Reviews Chemistry 2020年三月份封面。植物生物质降解酶与塑料降解酶的比较与应用展望，图中左侧为角质酶蛋白质三维立体结构，右侧为PET水解酶结构，两个酶的结构高度相似却展现不同的底物偏好性。Image credit: Dr. Carl Conway (Springer Nature Limited)

包披于陆生植物细胞表面的生物质 (plant biomass) 是地球上存量最多的可再生资源，人类种植食用和商用植物而产生了大量无法被人体消化利用的非淀粉类物质。和植物一同演化了数亿年的微生物具有各种酶介导系统来降解植物生物质，随着生物技术的演进，这些天然降解机制也被应用到植物生物质相关工业技术，如纸浆制作、食品和饲料添加剂、生物质转换生物燃料等，为生物质循环利用找到出路。另一方面，为人类生活带来便利的塑料产品性质稳定，不易被自然降解，但经年累月积累的塑料垃圾已成为地球巨大的生态环境负担，焚烧和掩埋是目前最常用来处理塑料废弃物的方法，但人们仍在不断的寻找对环境更友好的生物降解方案。从化合物结构层面看来，植物生物质与塑料有许多相似的地方 (表1)，如它们都是透过碳-碳或者碳-氧键组成的高分子碳氢化合物，表面疏水并可能形成结晶区。多年来的研究发现了一些具有降解塑料潜力的酶和微生物 (表1)，各国学者也在此基础上进行酶工程改造与应用，试图增加降解效率。2016年在日本的一处塑料回收场，分离出了一株能够以聚对苯二甲酸乙二酯 (polyethylene terephthalate，PET) 为唯一碳源的细菌 Ideonella sakaiensis 201-F6 ^[1]，这株细菌中的PET降解系统由数个酶组成，分析证实这些都不是全新的酶种，而是衍生自古老的酶反应机制：植物生物质降解酶。蛋白质结构分析显示了几个关键的位点突变与结合底物有关，这个发现说明了微生物对于塑料的出现采取了快速应变措施，使用现有酶种并引入一些突变，以改变活性区的特征。有鉴于此，回顾植物生物质分解酶是个重要的工作，比较植物生物质与塑料的结构与特性，借镜大自然演化的方向，看古老的机制如何为今日面临的挑战带来新的思路。文章针对非淀粉植物生物质以及六种最常见的塑料聚合物，分别对已知的降解酶进行叙述：

表1. 非淀粉植物生物质和塑料聚合物性质与微生物降解的综合比较 (表中引用文献为文章中编号)。

1. 包覆于植物最外层的角质 (cutin)，是通过酯键交联氧化或环氧化脂肪酸组成的网状组织 (图2A)。角质酶 (cutinase) 是目前唯一已知能水解角质的天然催化剂，其利用催化三联体水解酯键产生脂肪酸 (图2B)。角质酶的催化与结构研究都已经非常成熟，然而近年来由于角质酶能够分解酯键联结的塑料，因此角质酶的挖掘和改造受到极大的关注。

图2. (A) 角质的化学结构示意图，红色线代表酯键被角质酶水解后断裂的位置。(B) 角质酶三维立体结构，右方为催化三联体Ser120-His188-Asp175的放大图。

2. 橡胶 (rubber) 是植物特有的保护机制，其为单体上千个异戊二烯单元以碳-碳双键组成的超大聚合物 (图3A)。自然界中存在橡胶降解细菌可表达橡胶氧化酶来降解并代谢这些高分子，这些酶利用血红素螯和铁来对橡胶的碳-碳双键进行氧化裂解，小至十五个碳的异戊二烯化合物就能被细胞吸收利用。天然橡胶的韧性经由硫化反应 (vulcanization) 强化后，被制成各种产品并广泛的应用于人类社会中 (图3B)，而这些难以自然分解的硫化橡胶又变成了无法回收利用的废弃物。理论上橡胶分解细菌可以降解碳骨架，可惜无法改变硫化橡胶的交联状态。有报导指出锰过氧化物酶 (MnP) 可以透过脂质过氧化反应 (lipid peroxidation) 来达到橡胶脱硫的效果，这个方案同时解决了橡胶废弃物堆积以及自然橡胶来源有限的问题，是一个值得继续努力研究的方向。

图3. (A) 天然橡胶以及橡胶氧化酶切割后产物结构示意图，RoxA为外切酶，RoxB和Lcp为内切酶。(B) 硫化橡胶结构示意图。

3. 木质素 (lignin) 是地球上含量仅次于纤维素的天然聚合物，由三种酚类单体经过碳-碳键和碳-氧键组成的复杂化合物 (图4A)。大部分木质素分解酶来源于白腐菌、软腐菌和某些细菌，根据辅助底物的不同，分为使用氧气的漆酶 (laccase) (图4B)，和使用过氧化氢的过氧化物酶 (peroxidase) (图4C)。漆酶的氧化还原能力较低，只能作用于木质素中含量较少的酚类基团，添加小分子化合物作为介导系统 (laccase mediator system, LMS) 可以扩大漆酶的作用范围。降解木质素的过氧化物酶主要有三种：锰过氧化物酶、木质素过氧化物酶 (lignin peroxidase) 和多功能过氧化物酶 (versatile peroxidase)，它们是三维立体结构相似的带血红素酶。锰过氧化物酶具有锰结合模块，可螯合锰作为电子供体，主要作用于酚类基团；木质素过氧化物酶缺乏锰螯合模块，而是利用表面的色胺酸来介导长程电子传递 (long-range electron transfer)，主要作用于非酚类基团；多功能过氧化物酶具有上述两种特征，作用范围最广，可氧化酚类与非酚类基团。关于木质素降解酶作用机理还有很多不清晰的地方有待研究，但由于木质素是最大的芳香族化合物天然储存库，所以利用酶反应来提取有效成分的方法具有重要应用价值，此外，木质素组成与许多塑料非常相似，所以木质素分解酶在塑料生物分解的应用上将来可能具有相当大的应用潜力。

图4. 木质素的基本组成 (A) 木质素基本组成示意图；(B) 漆酶三维立体结构，虚线框内为活性区 (PDB ID, 2HRG)；(C) 三种分解木质素的过氧化物酶结构重迭图，绿色-锰过氧化物酶 (PDB ID, 3M5Q)，蓝色-木质素过氧化物酶 (PDB ID, 1LLP)；粉红色-多功能过氧化物酶 (PDB ID, BOQ)。上虚线框内为血红素结合域和锰螯合区，下虚线框内为蛋白质表面负责长程电子传递的色氨酸残基。

4. 多糖聚合物：纤维素 (cellulose) 是糖苷键连接的1,4-β-D-葡聚糖组成，这些微原纤 (microfibrillar) 透过分子间氢键与疏水作用力紧密的聚集在一起，成为强韧的结晶纤维素 (crystalline cellulose)。纤维素之间再由半纤维素 (hemicellulose) 和果胶 (pectin) 进一步交联，这就构成植物细胞壁的基本架构。多糖聚合物的酶介导降解系统非常庞杂，可大致分为内切酶与外切酶，根据辨认不同糖类以及侧链非糖类的修饰再进一步分类，这些酶全部都归类在CAZY data中 (http://www.cazy.org/  )，纤维素酶和半纤维素酶属于糖苷水解酶家族 (glycoside hydrolase, GH)，而果胶分解酶则大多属于多糖裂解酶 (polysaccharide lyase, PL) 家族。

即便是多糖分解酶降解相关研究已经如此透彻，也有令人意想不到的发展。近年来的研究指出，有一群原本被归类于糖苷水解酶GH61家族以及完全不具催化活性的糖结合域，实际上是一种带有金属铜的单加氧酶—lytic polysaccharide monooxygenase (LPMO) (图5)。LPMO与糖苷水解酶有很强的协同作用，两个酶种一起使用可将水解效力提升二十倍，蛋白质晶体结构显示LPMO的底物结合区非常平坦 (图5)，特别有利于附着到紧密的结晶区表面。多数塑料亦能形成稳定的结晶区，所以LPMO的作用机理对塑料生物降解的应用值得期待。

图5. 三个LPMO的复合体蛋白质晶体结构与PDB号码。结合于蛋白质上方的圆球状代表多糖底物，可见底物结合区较为平坦。

5. 塑料：目前生产的六种主要的塑料包括聚乙烯 (polyethylene, PE)、聚丙烯 (polypropylene, PP)、聚苯乙烯 (polystyrene, PS)、聚氯乙烯 (polyvinyl chloride, PVC)、聚对苯二甲酸乙二酯 (polyethylene terephthalate, PET)和聚氨酯 (polyurethane, PUR)。前四种聚合物透过碳-碳键相连较难分解 (图6)。PE是相对而言较容易被降解的碳-碳键结聚合物，一些在石油污染区被分离出来的烷烃类消耗微生物可能利用膜上的二铁单加氧酶 (diiron monooxygenase) 来分解PE。含有苯环的PS的生物降解较为困难，一个来源于木质素分解细菌的过氧化氢酶在有机-水双相系统中可以降解PS，但这种系统在实际应用起来较为复杂。近年的研究发现黄粉虫的肠道菌丛能消化分解PS，这些细菌的催化系统值得更多深入的研究 ^[2]。至于其他碳-碳键相连塑料的生物降解则非常低效，通常要在复杂的环境菌群中耗费数个月才有些微的降解，这部分还在等待更多的突破发现。

图6. 六种塑料单体分子结构式，PET和PUR虚线框分别为酯键与氨酯键。

PET和PUR分别透过酯键与氨酯键相连则较有可能被生物降解，但骨架中的苯环与烷烃增加了生物降解的难度。2016年报告的以PET作为唯一碳源的细菌 Ideonella sakiensis 201-F6，靠着分泌PET水解酶IsPETase到体外，把PET水解成小片段候再运送进细胞内进行代谢。这一个关键的PETase与来源于细菌的角质酶的序列相似度高达50 %，更有趣的是角质酶的底物和PET有一定的差异，PETase的底物结合区到底发生了什么改变呢? 郭瑞庭教授课题组于2017年解析PETase与底物类似物的晶体结构，显示底物结合区具有较大空间可以容纳较大的PET ^[3](图7)。

图7. 能水解PET的IsPETase(左)和来源于细菌的角质酶 TfCutinase(右)的三维立体结构。箭头指出底物结合区，可看出IsPETase宽阔的底物结合区可以容纳PET的芳香环基团，角质酶的相对位置则较为狭窄。

尽管种类繁多，但这些高分子分解酶具有一些共通性。首先，非淀粉的生物质以及塑料高分子都存在于胞外，所以这些酶必需是分泌型或者位于膜上才能发挥作用。其次，这些酶的分子量都偏小，有利于穿入复杂的高分子聚合物中进行反应。此外，活性区大多需要有一定的柔性，而底物结合邻近区域构型趋向平面则可能有利于附着到高分子的结晶区。这些信息对于了解自然演化的方向，未来设计、改造，以加强塑料分解酶的酶活与稳定性提供了非常重要的参考。

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Enzymatic degradation of plant biomass and synthetic polymers

Chun-Chi Chen, Longhai Dai, Lixin Ma, Rey-Ting Guo

Nat. Rev. Chem., 2020, DOI: 10.1038/s41570-020-0163-6

参考文献

[1] S. Yoshida, K. Hiraga, T. Takehana, I. Taniguchi, H. Yamaji, Y. Maeda, K. Toyohara, K. Miyamoto, Y. Kimura, K. Oda, A bacterium that degrades and assimilates poly(ethylene terephthalate), Science, 2016, 351, 1196-1199

[2] Y. Yang, J. Yang, W.M. Wu, J. Zhao, Y. Song, L. Gao, R. Yang, L. Jiang, Biodegradation and mineralization of polystyrene by plastic-eating mealworms: part 1. chemical and physical characterization and isotopic tests, Environ. Sci. Technol., 2015, 49, 12080-12086

[3] X. Han, W. Liu, J.W. Huang, J. Ma, Y. Zheng, T.P. Ko, L. Xu, Y.S. Cheng, C.C. Chen, R.T. Guo, Structural insight into catalytic mechanism of PET hydrolase, Nat. Commun., 2017, 8, 2106