季铵化哌嗪罗丹明——提升亮度的新型超分辨荧光染料

超分辨显微技术的开发和应用近年来取得长足的发展，但一直受限于荧光染料的亮度和稳定性。相较于传统光学成像，超分辨荧光成像建立在更大规模的光子统计数据的基础上。为了进一步提升成像分辨率、改善成像质量，人们希望设计出具有更高亮度以及更好光稳定性的荧光染料。

罗丹明染料虽然被广泛应用于超分辨成像，但其荧光亮度通常受激发后分子内扭转电荷转移（TICT）的非辐射跃迁过程的影响（图1a），其成像潜力并未得到完全的释放。通过对罗丹明的供体胺基进行环固定，可以抑制其激发态扭转，即TICT态，从而提升罗丹明的荧光量子产率。但依照这种策略，传统的罗丹明染料110的生物相容性较弱且合成路线复杂。为了抑制供体扭转，Lavis等（Nat. Methods, 2015, 12, 244）开发了吖丁啶取代的策略，有效的改善了染料的量子产率和光稳定性；徐兆超、刘晓刚等（J. Am. Chem. Soc., 2016, 138, 6960）进一步尝试了氮丙啶取代的策略，提出并证实了供体基态的“上-上”构型可以更有效地抑制TICT的形成。上述这些策略均通过空间效应抑制TICT态的发生。

值得注意的是，TICT的形成也受到电子效应的显著影响，但基于此效应改善染料的分子设计策略一直是空白。为此，大连理工大学的肖义（点击查看介绍）课题组和新加坡科技设计大学的刘晓刚（点击查看介绍）课题组合作提出了一种季铵化哌嗪的新策略。该策略通过将具有吸电子效应的季铵基团连接在供体芳香胺上，降低了胺基的整体供电子能力，使得罗丹明染料的TICT态更不稳定，从而有效抑制TICT态的形成。

如图1b，作者首先通过理论计算，比较了一系列供体胺基的离子化能。结果显示季铵化哌嗪具有最大的离子化能，其供电子效应最弱。接着，作者对传统的四甲基罗丹明和季铵化哌嗪罗丹明在水中的S₁势能面进行了比较（图1c）。计算结果显示相较于四甲基罗丹明，季铵化哌嗪罗丹明给体的旋转能垒更高，且驱动能更小，因而更不容易形成TICT态。作者推测这种染料具有更高的亮度。

图1 理论计算预测季铵化哌嗪策略可以抑制TICT态形成。图片来源：J. Am. Chem. Soc.

为了验证上述计算结果，作者合成了季铵化哌嗪罗丹明，并与传统四甲基罗丹明的光物理性质进行了比较（图2a）。在水溶液中，季铵化哌嗪罗丹明的荧光量子产率（0.92）大约是四甲基罗丹明（0.47）的两倍，并且保持了罗丹明染料特有的高摩尔消光系数，有很高的亮度（荧光量子产率X摩尔消光系数）。作者进一步合成了季铵化哌嗪罗丹明的羧基衍生物，将其标记在生物大分子-抗体蛋白上，测量了其单分子光物理性质（图2b）。通过一系列详细的比较验证，作者发现季铵化哌嗪罗丹比四甲基罗丹明有更好的单分子亮度及更多的总收集光子数，表现出更强的单分子定位超分辨成像潜力。光谱及单分子的实验结果与理论计算的预期一致。

图2 季铵化哌嗪策略的光谱和单分子研究。图片来源：J. Am. Chem. Soc.

为了证实这种染料的定位型超分辨成像的能力，作者紧接着尝试运用标记有季铵化哌嗪罗丹明的抗体进行了微管标记的超分辨成像。由于季铵化哌嗪罗丹明的优秀光物理性质，超分辨成像清晰而准确地揭示了微管交错、弯曲的结构。在同等条件下，作者还比较了四甲基罗丹明的成像效果（图3），进一步展示了季铵化哌嗪罗丹明在定位型成像中可以提供更高的定位密度和更好的定位型超分辨成像的能力。

图3 季铵化哌嗪罗丹明（MPR）与四甲基罗丹明（TMR）在定位型超分辨成像微管的比较研究。图片来源：J. Am. Chem. Soc.

为了进一步在活细胞水平上验证季铵化哌嗪罗丹明染料的成像优势，作者开发了两种针对亚细胞器标记的探针，即细胞膜探针（Mem-R）和溶酶体探针（Lyso-R，其选择性标记能力在作者之前的工作中已经报道（RSC Adv., 2014, 4, 37547））。由于小分子探针对结构标记的可逆性，以及细胞内本身存在的氧化还原环境，这两种小分子探针在靶标结构上均展现出不依赖于成像液体系的闪烁特征（亮暗态的交替）。基于这些闪烁的单分子信号，作者成功地对活细胞的细胞膜和溶酶体进行了定位型超分辨成像（图4）。作者还进一步对标记在活细胞膜上的染料进行了高密度的单分子追踪，并对活细胞溶酶体的动态超分辨成像进行了分析。上述结果均显现了季铵化哌嗪罗丹明在定位型超分辨成像的良好应用潜力。

图4 季铵化哌嗪罗丹明探针用于细胞膜和溶酶体的定位型超分辨成像。图片来源：J. Am. Chem. Soc.

最后，为了更进一步地说明季铵化哌嗪策略的可拓展性，作者还开发了萘酰亚胺和NBD染料的衍生物。作者通过理论计算和光谱实验证实了这些季铵化哌嗪衍生物比它们的二甲胺类似物能更有效地抑制TICT态的形成，具有更高的荧光量子产率。这些结果证实了季铵化哌嗪策略改善推拉结构染料的通用性，并为未来开发具有高亮度的、可适用于超分辨成像的荧光染料提供了很好的指导。

这一成果最近发表在Journal of the American Chemical Society 杂志上。大连理工大学博士研究生叶智伟、大连理工大学精细化工国家重点实验室工程师杨薇、新加坡科技设计大学王超博士和大连理工大学博士研究生郑莹为共同第一作者。通讯作者是大连理工大学精细化工国家重点实验室工程师杨薇、新加坡设计大学刘晓刚教授和大连理工大学精细化工国家重点实验室肖义教授。项目得到了中国国家自然科学基金（Nos. 21376038, 21421005, 21576040, 21776037, 21804016），新加坡科技设计大学（Singapore University of Technology and Design，T1SRCI17126）和SUTD-MIT International Design Center（IDG31800104）的资助。

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面，或点此查看原文）：

Quaternary Piperazine-Substituted Rhodamines with Enhanced Brightness for Super-Resolution Imaging

Zhiwei Ye, Wei Yang, Chao Wang, Ying Zheng, Weijie Chi, Xiaogang Liu, Zhenlong Huang, Xiaoyuan Li, Yi Xiao

J. Am. Chem. Soc., 2019, 141, 14491–14495, DOI: 10.1021/jacs.9b04893

导师介绍

肖义

https://www.x-mol.com/university/faculty/9413

刘晓刚

https://www.x-mol.com/university/faculty/67660