用于可视化和监测活细胞和组织粘度的线粒体靶向近红外荧光探针

注：文末有本文科研思路分析

肝病已经成为一种引发高死亡率疾病。其中，肝硬化作为一种慢性进行性肝病，是由肝纤维化长期转变而来。正常情况下，肝星状细胞处于静止状态，当肝脏受到炎症或机械刺激等损伤时，肝星状细胞增殖并被激活，其表型由静止型转变为激活型，从而转变为“肌成纤维细胞”，并伴随着粘度增加。长此以往，便演变成肝硬化。目前，针对肝硬化疾病的宏观和微观诊断方法都有很多局限，且大多数只提供弹性数据，而肝纤维化是一种弥漫性疾病，没有正常的肝组织弹性参数可以作为背景比较，这为早期诊断带来了困难。

武汉大学刘志洪（点击查看介绍）团队设计的小分子粘度探针则打破这种局限，构建了一种既能无损伤又能实时监测肝纤维化病理进程的监测方法。他们设计了一种基于TICT（分子内扭转电荷转移机制）的新型近红外荧光探针（NI-VIS），以喹啉为电子受体，二甲基苯胺为电子给体。在粘度较低的环境下，探针的分子内旋转键能高速旋转，因此产生很低的背景荧光信号；而在粘度较高的液体环境中，TICT受阻，分子发射出强烈的近红外荧光信号（= 670 nm）。随着粘度由 1.0 cP 增加到 999 cP，探针发光增强可高达167倍。

系列实验证明，NI-VIS可应用于从细胞到组织不同层次的成像，还可对斑马鱼体内的微环境粘度进行可视化成像。同时，NI-VIS可应用于肝硬化模型，在实验中通过CYP2E1（细胞色素酶）激活诱导小鼠肝毒性，并投喂高胆固醇饲料，以含15%乙醇的水作为饮用水，诱发小鼠肝硬化，然后在不同组织深度对小鼠肝硬化组织进行生物成像。实验观察到正常肝组织样品显示出微弱的荧光信号，而肝硬化组织中的NIR荧光信号显著增强。以上结果表明，NI-VIS可成功应用于肝硬化组织粘度成像，从而可将肝硬化肝组织与正常肝组织区分，成像深度为40-120 μm。

NI-VIS 探针作为粘度响应的小分子荧光探针，具有灵敏度高、生物光损伤小、生物相容性好以及实时检测等优点，因此，可对细胞内微环境的异常变化进行高灵敏检测。例如，线粒体肿胀而表现出的粘度增加就与许多疾病相关，如神经变性疾病帕金森氏病、阿兹海默氏病和动脉粥样硬化。同时，作为近红外发射的探针，NI-VIS拥有着荧光背景信号低、光子穿透深度大等优势，对于生物活体分析具有重要意义，在临床医学应用方向显示出巨大潜力。

这一成果近期发表在Analytical Chemistry上，文章的第一作者是武汉大学本科生张钰颖，通讯作者刘志洪教授。

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A Mitochondrial-Targeting Near-Infrared Fluorescent Probe for Visualizing and Monitoring Viscosity in Live Cells and Tissues

Yuying Zhang, Zhen Li, Wei Hu, Zhihong Liu*

Anal. Chem., 2019, 91, 10302-10309, DOI: 10.1021/acs.analchem.9b02678

导师介绍

刘志洪

https://www.x-mol.com/university/faculty/13598

科研思路分析

Q：这项研究最初是什么目的？或者说想法是怎么产生的？

A：在近期，许多荧光探针被报道用于线粒体黏度成像，但大多仍存在响应倍数低、选择性差、背景荧光信号强等局限性。而近红外(NIR)荧光染料具有背景低、穿透深度大的优点，是一种很有前景的检测细胞和活体内生物标志物的工具。受到如上启发，我们团队想要设计一种拥有近红外发射的粘度探针，该探针不仅拥有线粒体靶向定位能力，还具有临床疾病诊断的应用前景。众所周知，肝硬化影响着全球数亿患者，如果能在早期监控肝组织的粘弹性参数变化同时进行治疗，就可以防止纤维化患者向肝硬化的演变，这在临床上具有重要意义。然而，目前用于检测肝硬化的方法都有局限性，且大多只提供组织弹性数据。因此，我们在得到体外检测性能优良，响应倍数高，近红外发射的 NI-VIS 探针后，构建了一个用以监测肝硬化组织粘度的模型。

Q：研究过程中遇到哪些挑战？

A：在本项研究一开始，设计分子构型具有一定难度。想要得到稳定性好，量子产率高，发射波长较长的粘度探针并不容易。对于荧光团的选择，一开始我们团队考虑的是罗丹明类，因为罗丹明基团拥有非常优越的稳定性。但实验结果表明粘度响应倍数不理想，因此重新设计了喹啉类探针。此外，在这项工作中有许多生物实验，如细胞成像，小鼠肝硬化组织成像，斑马鱼体内成像等，这些实验对仪器的要求都较高，并且涉及一些化学生物学的知识。

Q：该研究成果可能有哪些重要的应用？

A：目前用于检测肝硬化的宏观和微观方法都有许多局限，并且大多只提供组织弹性数据。由于肝纤维化是一种弥漫性疾病，且没有正常的肝组织弹性参数作为背景比较，对早期诊断造成了困难。NI-VIS作为近红外探针，得益于其对生物样品的低损伤和组织成像的高深度，可应用于检测肝硬化肝组织黏度增加，从而提供更加有效的诊断信息。同时，单独的粘度变化数据在精准定位上有些欠缺，在这一研究基础上应在肝硬化病理过程中选择可共同检测的标志物，将两项结果结合，精确应用于肝硬化诊断。以上结果表明，这种新型近红外荧光探针拥有良好的线粒体定位能力，并且对粘度变化有很高的灵敏度，可以为生物样品中的活细胞和组织黏度监测提供有力的工具，在生物医学领域显示出巨大的潜力。并为小分子荧光探针的设计开阔了新思路。