三篇Nature长文揭示脑瘤-神经元间形成突触结构以促进肿瘤生长

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脑肿瘤患者可伴随多种严重症状，如头疼及认知功能减退，取决于脑肿瘤的类型、大小、部位及生长率。因此，对控制肿瘤生长因素的理解能促进我们开发出减缓肿瘤进程的治疗手段并提高患者的生命质量。对于脑肿瘤生长为何如此迅速这一重要科学问题，本期Nature同时刊出三篇长文，以“背靠背”形式共同报道了脑内肿瘤与神经元之间形成的兴奋性突触结构，并揭示这种突触联系如何促进肿瘤生长，并附上Dangerous liaisons as tumors form synapses的同期评述。本期BioArt对其中一篇文章做出主要解读，并附上其他两篇文章的简单介绍。

高级别(high-grade)胶质瘤(以下简称胶质瘤)为成年及儿童脑部发病率最高的恶性肿瘤，致死致残率极高，预后极差。作为临床上尤其棘手的肿瘤类别，人们对胶质瘤病理生理学机制的了解仍然非常有限。胶质瘤主要浸润大脑及脊髓，而很少见到在中枢神经系统外的生长。已知的是，胶质瘤的进程不仅受细胞固有机制的调控，还受肿瘤微环境的调节。作为肿瘤微环境的重要组成部分，神经元可通过分泌突触蛋白neuroligin-3(NLGN3)，以神经元活动性依赖的方式促进胶质瘤恶性生长【1】，这一机制却无法以传统肿瘤信号通路充分解释。也有研究发现，NLGN3可诱导胶质瘤表达多种突触功能相关基因【2】，提示胶质瘤可能参与突触信号传递。然而，突触及神经电信号如何参与并促进胶质瘤进程，我们仍然不清楚。

2019年9月18日，来自美国斯坦福大学的Michelle Monje研究组在Nature杂志在线发表了题为Electrical and synaptic integration of glioma into neural circuits的研究论文，通过多重技术手段鉴定出了胶质瘤和神经元之间的突触传递，进一步解释突触传递及神经电信号在胶质瘤进程中的重要作用。该研究为同一课题组此前于2015年5月在Cell杂志【1】及2017年9月在Nature杂志【2】发表的多项重要工作的延伸，并与另外两个课题组以“背靠背”形式在同期Nature发表的长文【3,4】互相佐证，进一步彰显了该工作的突出重要意义。

简单说来，Monje课题组报道的这篇Nature文章，通过单细胞测序、突触形态学与电生理学研究鉴定出了胶质瘤和神经元之间的相互作用，随后进一步在电生理上揭示了两种不同机制(图1)，再通过光遗传学及药理学手段促进或抑制胶质瘤生长，最后在临床病人上验证了临床前动物模型的机制(详见后文分析)，从而指导我们更好利用突触及环路机制进行神经胶质瘤的精准治疗。

图1. 本文提示的神经元-胶质瘤在肿瘤微环境下的相互作用模型。

首先，为检查原代人胶质瘤的突触相关基因表达特征，研究人员分析了主要几类成人及儿科高级别胶质瘤活体组织样品在治疗前的单细胞转录组信息(图2a-b)，包括成人异柠檬酸脱氢酶(IDH)突变胶质瘤、成人IDH WT胶质瘤以及儿科H3K27M 弥漫性中线胶质瘤(DMG，也被称为弥漫性脑桥胶质瘤，DIPG)。其中发现，恶性胶质瘤细胞内广泛存在谷氨酸受体及突触后结构基因的表达。突触相关基因的富集主要发现于少突胶质细胞前体细胞(OPC)样胶质瘤内(正常情况下OPC主要发挥突触后功能)。这一发现提示，病人来源H3K27M+异种移植胶质瘤的单细胞转录组具有OPC样突触基因富集特征。

既然原代人胶质瘤细胞广泛表达突触基因，那么胶质瘤和神经元在肿瘤微环境下，是否可以形成结构性突触(structural synapse)？电镜下，研究人员发现原代胶质瘤具有清晰突触超微结构(图2c-d)。进一步的胶质瘤细胞共培养发现，与Nlgn3KO神经元共培养的胶质瘤细胞的神经元突触前puncta共定位显著降低(图2e-f)，进一步提示了NLGN3在神经元-胶质瘤突触形成过程中的重要作用，这与NLGN3所具有的经典致癌信号通路中的作用是显著不同的【2】。

图2. 胶质瘤突触的转录组及结构特征。

在确定胶质瘤和神经元之间存在结构性突触后，研究人员自然而然想回答的问题是，在肿瘤微环境下形成的结构性突触是否具有电生理上的功能特征？为回答这一问题，研究人员使用4种不同病人来源的原位异种移植模型。将GFP标记的胶质瘤细胞立体定位注射到小鼠海马环路的CA1区，在充分移植和生长后，研究人员对急性海马脑片GFP+胶质瘤细胞进行全细胞膜片钳记录，通过不同工具药证明了胶质瘤细胞的兴奋性突触后电流(EPSCs)依赖于神经元动作电位，且该突触传递通过AMPA受体介导(图3)。因此，电生理学证据提示了神经元和胶质瘤之间存在真正意义上的突触。同期背靠背发表的另外一篇Nature也提供了该证据【3】。后续以铯离子替代细胞外钙离子的实验也证明了谷氨酸能神经元和部分异种移植的人源胶质瘤存在类似于正常OPC之间的突触联系。

图3. AMPA受体介导的胶质瘤EPSCs

进一步的电生理证据提示，部分胶质瘤细胞表现出延长电流(prolonged currents, > 1sec)及显著低输入电阻，与正常神经活动在星形胶质细胞上诱发的电流相似，且细胞外钾离子浓度升高可促进这种非突触依赖的延长电流的产生(图4)。这些证据提示，星形胶质细胞上的缝隙连接(gap junction)很可能是产生低输入电阻的重要原因。因此，研究人员转至研究胶质瘤细胞上的缝隙连接。

图4. 胶质瘤表现出神经活动依赖的钾电流

微管相关缝隙连接已被发现参与星形胶质肿瘤的形成和发展【5】。众所周知，缝隙连接的主要生理功能是实现细胞之间的直接物质和信息交换，那么，胶质细胞的缝隙连接如何参与到胶质瘤的生长和浸润呢？研究人员通过给单个胶质瘤细胞内注射低分子量生物胞素染料，并加用缝隙连接阻滞剂，证实了神经活动可增加细胞外钾离子浓度，引起胶质瘤去极化，而胶质细胞网络中存在的缝隙连接能放大细胞外钾离子环境改变引起的神经活动性改变。这一结论同时能被双光子钙成像实验在神经网络水平进一步佐证(详见原文补充数据的多个视频)。

至此，本文已经证明了胶质瘤细胞核神经元之间存在的谷氨酸能化学突触及神经活动依赖、非突触性钾电流，可进一步解释为什么胶质瘤是电活性组织(electrically active tissue)。另外一个重要问题是，胶质瘤存在瘤内和瘤间的高度细胞异质性(cellular heterogeneity)，即非常少量存在的瘤细胞却可对肿瘤进程发挥巨大作用。为研究胶质瘤组织异质性和突触信号、电信号之间的关联，研究人员对643份少儿胶质瘤细胞进行了电生理学特征鉴定，发现约5-10%的胶质瘤表现出EPSCs，而40%的胶质瘤细胞对神经活动表现出延长电流。这种胶质瘤间的异质性在分子水平上特异的胶质瘤亚型上表现更为明显(如H3K27M+胶质瘤)。

本文已证实神经元活动可通过两种不同机制调节神经元活动性，从而诱导胶质瘤细胞膜去极化。但为证明胶质瘤细胞膜去极化和胶质瘤增生之间存在关联，研究人员使用光遗传手段来使异种移植的胶质瘤细胞去极化(图5a-d)，发现胶质瘤去极化可显著促进异种移植胶质瘤增生。而另外一个需要回答的重要问题是，这两种电化传递机制哪一种更重要？研究人员首先研究了AMPA受体介导的EPSCs的重要性，通过在胶质瘤内过表达野生型GluA2亚基、显性失活突变亚基及GFP对照，发现异种移植野生型GluA2亚基的小鼠存活时间最低(图5e)，而移植显性失活突变亚基的小鼠存活时间最长。这些结果表明，胶质瘤内激活AMPA受体以促进胶质瘤生长是通过神经元-胶质瘤之间的微环境相互作用所介导。进一步药理学实验证明，通过阻滞AMPA受体的抗癫痫药物吡仑帕奈可将胶质瘤增生率降低至50%(图5k)，而缝隙连接阻滞剂甲氯芬那酸同样可将胶质瘤增生率降低至相似水平(图5l)。因此，这一重要数据提示，靶向AMPA受体依赖的EPSCs机制和靶向缝隙连接机制，均能显著降低异种移植胶质瘤的增生。

图5. 胶质瘤细胞膜去极化可促进胶质瘤进程

从转化医学角度看，本文始于人源胶质瘤样品的单细胞测序结果(图1a-b)，通过人源异种移植至小鼠大脑观测到了突触及电信号引起的肿瘤微环境神经活动变化，进而引起胶质瘤细胞膜去极化(图2-4)，那么，这一重要机制是否可在临床病人上得到验证？换句话说，临床前动物模型得到的神经元过度兴奋的结果能否预测胶质瘤患者的临床特征？研究人员在三位清醒成年受试者进行了术中皮层脑电图记录，使用70-110 Hz高频功率(high gamma frequency power)检测患者的神经元放电频率及场电位，这些参数均在皮层过度兴奋时可观察到。研究人员在坏死结节核心区以外发现了显著增加的高频功率，支持此前在动物模型上观察到的神经元过度兴奋特征。也就是说，随着神经元动作电位导致细胞外钾浓度升高，胶质瘤微环境的神经元兴奋性增加可增加非突触性的胶质瘤延长钾电流，也可增加突触性的神经元-胶质瘤兴奋性EPSCs。

总的说来，本文是一篇思路非常清晰、研究手段多样、且临床意义重大的Nature佳文。笔者想特别强调本文的研究策略和思路。首先，基于课题组前期的积淀【1,2】，研究人员集中于胶质瘤周围神经活动对胶质瘤生长的影响。由病人来源肿瘤组织的单细胞转录组数据和电镜实验提供了强烈证据——恶性胶质瘤细胞内广泛存在谷氨酸受体及突触后结构基因的表达，并具有突触结构。随后为验证该临床证据，研究人员转而使用临床前动物模型，将人源胶质瘤细胞异种移植至小鼠大脑，使用电生理、双光子钙成像、光遗传学技术充分论证了该胶质瘤-神经元形成的突触结构具有完整电生理学功能。然而，在电生理学研究中意外发现了延迟电流和低输入电阻的存在，提示缝隙连接机制。因此，模拟突触机制的光遗传学操控也佐证了肿瘤微环境的神经活动在肿瘤生长中的作用。更重要的是，研究人员以预测效度水平证明了靶向该机制的治疗药物策略能显著降低肿瘤增生率，这也是本文具有重要意义的发现。最后，为进一步验证临床前动物模型上发现的机制，研究人员招募病人进行皮层脑电图研究，验证了胶质瘤核心区外存在和动物模型上观察到类似的神经元过度兴奋特征。因此，从转化医学角度，证据始于临床，扩展于动物模型的基础研究，最后回归到临床验证，形成了一条完整的证据链。同时，另外两篇同期Nature长文“背靠背”与本文结论互相佐证，将很大程度上将脑肿瘤突触联系这一新兴领域的推向研究焦点，预示着一个重要学科方向的出现。

图6. 由本文总结出如何使用临床前动物模型研究重大临床问题

第二篇同期Nature长文，来自德国海德堡大学的Thomas Kuner课题组，题为Glutamatergic naptic input to glioma cells drives brain tumour progression的研究论文，同样报道了突触前神经元-突触后胶质瘤细胞之间存在真正的化学突触(bona fide chemical synapse)。这篇文章同样报道了胶质瘤和神经元之间存在的超微结构，称为Neurogliomal synapses(NGS)，并进一步以超分辨率3D直接随机光学重建显微镜(dSTORM)识别到了相应突触后致密物的标记物，揭示了VGLUT1的存在。随后也进行了人源胶质瘤的RNA-seq，从分子水平揭示了含AMPA受体的突触成分。随后以膜片钳手段在胶质瘤细胞记录到了AMPA受体介导的电流。这篇文章也观察到了低输入电阻的存在，也进一步以甲氯芬那酸抑制缝隙连接得到佐证。有趣的是，这篇文章用到了另一种抗癫痫药加巴齐内。与上一篇Nature长文不同的是，这篇文章还以电生理记录结合光遗传手段揭示了肿瘤-微管-胶质瘤网络内的细胞内钙信号的重要交通作用(图7)。

图7. 第二篇Nature长文的工作模型总结 (来自原文补充数据10)

第三篇同期Nature长文，来自瑞士洛桑联邦理工学院的Douglas Hanahan研究组(第一作者为华人学者Zeng Qiqun博士)，题为Synaptic proximity enable NMDAR signaling to promote brain Metastasis的研究论文，主要揭示了乳腺癌转移至大脑的机制，观察到谷氨酸激活NMDA受体机制，随后进一步揭示突触前神经元-突触后神经元-星形胶质细胞之间形成的三重突触结构以提供谷氨酸来源，以刺激大脑肿瘤生长(图8)。

图8. 第三篇Nature长文的工作模型总结 (来自原文图4)

最后，笔者总结一下同期Nature发表的评述文章的简要介绍【6】。这三篇Nature长文共同报道了大脑内肿瘤细胞能与神经元形成兴奋性突触，从而促进肿瘤生长。这与教科书上对于兴奋性突触的描述是一致的——兴奋性突触通过使用谷氨酸作为神经递质，进行突触前神经元与突触后神经元之间的信号交流。突触前神经元释放谷氨酸以激活突触后神经元上的谷氨酸受体，分别为AMPA受体和NMDA受体，从而引起跨膜离子流动，产生去极化并引起兴奋。

胶质细胞作为大脑内除神经元外的另外一种重要细胞类型，主要围绕突触结构，通过移除神经递质或调控细胞外钾离子来调节大脑信号传递。其中健康胶质细胞形成的细胞连接网络的主要结构为缝隙连接，可通过钙离子进行相互交流。而本期Nature报道的三篇长文，在这副教科书级重要基本知识点覆盖的前景图的基础上，进一步完善和揭示了兴奋性突触和胶质细胞在肿瘤微环境下的如何促进肿瘤侵袭及增生。其中关于胶质瘤的两篇文章均通过电镜揭示了胶质瘤的肿瘤微管上具有的兴奋性突触结构特征，通过分子生物学手段揭示了其突触相关基因表达谱，通过电生理学手段证明了这些突触具有生理学功能，同时结合转录组分析和电生理学工具药手段揭示了兴奋性突触上表达的AMPA受体介导的效应，并通过不同机制的药理学手段提示(1)靶向AMPA受体及(2)靶向缝隙连接和钙信号对于肿瘤生长的治疗效应，也通过光遗传学操控来促进肿瘤生长。而第三篇Nature长文进一步揭示了兴奋性突触上NMDA受体和谷氨酸递质在乳腺癌在大脑内侵袭中的作用，更一步完善了脑肿瘤和兴奋性神经元之间联系的全景。总而言之，笔者认为这三篇Nature长文开启了一个全新的方向，提示了靶向谷氨酸受体、突触形成和突触后信号通路途径可能成为降低脑肿瘤增生的重要治疗手段。

图9. 同期Nature长文的工作模型总结 (来自原文图1)

原文链接：

https://doi.org/10.1038/s41586-019-1563-y

https://doi.org/10.1038/s41586-019-1564-x

https://doi.org/10.1038/s41586-019-1576-6

https://doi.org/10.1038/s41586-019-1564-7

1. Venkatesh HS, Johung TB, Caretti V, Noll A, Tang Y, Nagaraja S, Gibson EM, Mount CW, Polepalli J, Mitra SS, Woo PJ, Malenka RC, Vogel H, Bredel M, Mallick P, Monje M. (2015) Neuronal Activity Promotes Glioma Growth through Neuroligin-3 Secretion. Cell. 161(4):803-16

2. Venkatesh HS, Tam LT, Woo PJ, Lennon J, Nagaraia S, Gillespie SM, Ni J, Duveau DY, Morris PJ, Zhao JJ, Thomas CJ, Monie M. (2017) Targeting neuronal activity-regulated neuroligin-3 dependency in high-grade giolma.Nature.549(7673):533-537.

3. Venkataramani V. Glutamatergic synaptic input to glioma cells drives brain tumour progression. (2019).Nature.https://doi.org/10.1038/s41586-019-1564-x

4. Zeng et al., Synaptic proximity enable NMDAR signaling to promote brain Metastasis. (2019).Nature. https://doi.org/10.1038/s41586-019-1576-6

5. Osswald M, Jung E, Sahm F, et al., Brain tumour cells interconnect to a functional and resistant network. (2015).Nature. 528(7580):93-8.

6. Barria A. Dangerous liaisons as tumours form synapses. (2019).Nature. https://doi.org/10.1038/s41586-019-1564-7