超分辨荧光染料设计的新策略——延长螺内酰胺罗丹明亮态寿命

超分辨荧光显微成像技术因其能够突破光学衍射极限，实现纳米级甚至分子级别的成像分辨率，而倍受青睐。借助于特异性的超分辨荧光探针，这项技术可以标记（单色）和区分（多色）蛋白等生物大分子，并在高分辨率尺度下揭示活细胞内活性分子的动态生理过程，因而相对电子显微镜具有较大的优势。因此，该技术自诞生以来快速发展和改进，被广泛应用于生物学与基础医学等研究领域，并已成为观测细胞或组织超微结构和揭示细胞内物质相互作用的重要方法之一。该领域的开拓者Eric Betzig、Stefan W. Hell和William E. Moerner也因为其卓越的贡献而共同分享了2014年诺贝尔化学奖。

荧光染料是支撑超分辨成像技术的核心要素之一，尤其对于光激活定位显微成像（PALM）等基于单分子定位的成像技术。然而，目前对超分辨荧光染料的开发仍然缺乏针对性的设计策略以及方法。为实现活细胞超分辨成像，必须在保持空间分辨率的同时提高其时间分辨率，这要求染料分子能够进行多次亮暗态的转换并提供充足的光子统计信息。前人的设计策略仅局限于提高染料的荧光量子产率，忽视了另外一个极为重要的特性：染料激活后的亮态寿命。为此，大连理工大学肖义课题组和辽宁大学于海波课题组合作开发了一种应用于超分辨成像的罗丹明类荧光染料设计策略，实现了染料分子亮态时间的延长。

图1. 螺内酰胺罗丹明亮态时间延长策略。Reprinted from permission from reference1. Copyright 2019 American Chemical Society.

事实上，荧光探针领域早已广泛认识到，罗丹明螺环类染料的开环双离子形式能够被酸性环境稳定。但是将酸性环境直接、准确而无害的导入到活细胞中是十分困难的。因此，作者巧妙地将羧基直接引入到罗丹明螺环结构，合成新型染料甘氨酸罗丹明（Rh-Gly）。这样，该染料在激活的过程中形成的氮负离子可以被分子内氢键稳定，从而稳定激活的罗丹明双离子盐，实现了延长激活产生亮态分子寿命的目的（图1）。

作者首先通过光激活实验，验证了甘氨酸罗丹明具有光激活的特性；接着，通过pK_a值的测量，揭示了甘氨酸罗丹明比其甲酯化类似物具有更敏感的质子响应，验证了分子内氢键的作用。随后，在单分子水平上，作者进行了一系列邻接羧基罗丹明及其甲酯化类似物的对比，验证了邻近酸性基团可以提高染料亮态的持续时间（图2）。另外，邻近羧基的罗丹明还显现了更快的发光速率、更高的总收集光子数等其它可显著提高超分辨成像分辨率的光物理特征。

图2. 在单分子水平比较一系列螺内酰胺罗丹明的亮态时间。Adapted with permission from reference1. Copyright 2019 American Chemical Society.

最终，作者将甘氨酸罗丹明成功用于活细胞超分辨成像（图3）。首先，基于甘氨酸罗丹明优异的单分子光物理性质和线粒体靶向标记功能，实现了不依赖于成像液的活细胞线粒体超分辨成像，达到了较高的空间分辨率（～50 nm）和时间分辨率（10 s）。同时，还可以指示活细胞线粒体中呼吸作用较强的活性区域。

不仅如此，作者还发展了具有融合蛋白标签底物和具有生物大分子标记能力的两种甘氨酸罗丹明衍生物。利用前者，实现了活细胞的细胞核组蛋白H2B的超分辨成像；利用后者，实现了固定细胞中微管α-tubulin的超分辨成像。

图3. 活细胞线粒体、细胞核组蛋白和微管超分辨成像。Adapted with permission from reference1. Copyright 2019 American Chemical Society.

这一成果近期发表在Journal of the American Chemical Society 杂志上，大连理工大学博士研究生叶智伟、辽宁大学于海波副教授、大连理工大学分析测试中心工程师杨薇和大连理工大学博士研究生郑莹为共同第一作者，通讯作者是辽宁大学于海波副教授和大连理工大学精细化工国家重点实验室的肖义教授。项目得到了中国国家自然科学基金（Nos. 21421005, 21576040, 21776037 和 21804016）的资助。

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面，或点此查看原文）：

Strategy to Lengthen the On-Time of Photochromic Rhodamine Spirolactam for Super-resolution Photoactivated Localization Microscopy

Zhiwei Ye, Haibo Yu, Wei Yang, Ying Zheng, Ning Li, Hui Bian, Zechen Wang, Qiang Liu, Youtao Song, Mingyan Zhang and Yi Xiao

J. Am. Chem. Soc., 2019, 141, 16, 6527-6536, 10.1021/jacs.8b11369

导师介绍

肖义

https://www.x-mol.com/university/faculty/9413

(1) Ye, Z.; Yu, H.; Yang, W.; Zheng, Y.; Li, N.; Bian, H.; Wang, Z.; Liu, Q.; Song, Y.; Zhang, M.; Xiao, Y. Strategy to Lengthen the On-Time of Photochromic Rhodamine Spirolactam for Super-Resolution Photoactivated Localization Microscopy. J. Am. Chem. Soc., 2019, 141 (16), 6527–6536.