基于单颗粒光谱技术实现碱性磷酸酶的高灵敏检测

碱性磷酸酶(ALP)作为一种重要的信号转导酶，可以通过水解磷酸单酯将底物分子上的磷酸基团除去。ALP水平的异常与许多病理过程密切相关，目前，ALP已被认为是许多人类疾病诊断的关键生物标志物之一，如骨病、乳腺癌、前列腺癌、肝功能障碍、代谢综合征等。因此开发一种高灵敏、可靠检测ALP活性的方法，对于临床疾病诊断和深入了解磷酸水解的机理尤为重要。

目前用于检测ALP活性的方法主要包括荧光光谱法、比色法、拉曼光谱法以及电化学分析法等。虽然这些方法已经实现了对ALP的定量检测，但这些基于均质样本的分析方法不仅会掩盖其独特的信号并可能出现假阳性输出。例如荧光光谱法中荧光信号会受到荧光探针的光漂白和自猝灭的影响，比色法由于细微的颜色变化无法用肉眼准确分辨，灵敏度和重现性受到限制。单分子光谱技术由于可以实现物质在单分子水平上的超灵敏观测，不仅可以有效避免来自均质样本的假阳性输出，还能够实时监测动态反应过程，近年来已在生物医学方面得到了越来越广泛的研究。近日，南开大学肖乐辉教授（点击查看介绍）团队基于单颗粒光谱技术，通过测定ALP加入前后的二氧化锰（MnO₂）负载金纳米颗粒在红色通道和绿色通道强度的比率变化，实现了对ALP的高灵敏检测。

其工作原理如图1所示，作者首先合成了尺寸均一、分散性良好的二氧化锰包覆的金纳米颗粒（GNP@MnO₂ SP），在ALP存在的条件下，抗坏血酸磷酸酯（AA2P）水解生成抗坏血酸和磷酸根，抗坏血酸可以将金纳米颗粒表面包覆的二氧化锰还原成Mn²⁺，从而使金纳米颗粒表面包覆的二氧化锰层被刻蚀。金纳米颗粒表面包裹的二氧化锰被刻蚀后，金纳米颗粒局部环境的介电常数发生改变，使金纳米粒子局域表面等离子体共振（LSPR）光谱蓝移，从而引起金纳米粒子在红色和绿色通道中的强度变化。因此，基于单颗粒光谱技术，在单颗粒水平上通过测定金纳米颗粒在红色通道和绿色通道强度的比率变化，实现了对ALP的高灵敏分析检测。

图1. 基于单颗粒光谱技术检测ALP的原理图和暗场显微成像光路图。

相关成果近期发表在Analytical Chemistry 上。

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Single-Particle Enzyme Activity Assay with Spectral-Resolved Dark-Field Optical Microscopy

Fuyan Wang, Yiliang Li, Yameng Han, Zhongju Ye, Lin Wei, Hai-Bin Luo, and Lehui Xiao

Anal. Chem., 2019, 91, 6329-6339. DOI: 10.1021/acs.analchem.9b01300

导师介绍

肖乐辉，男，南开大学化学学院研究员，博士生导师。主要围绕分子识别、动态示踪以及时空分辨测量在单分子、单颗粒层面开展研究工作。发展了具有单分子灵敏度的单颗粒显微测量技术用于疾病关联标志物的化学测量，开发了单颗粒三维取向测量显微成像技术用于纳米载体颗粒与磷脂膜相互作用动态观察，实现了纳米尺度化学反应过程的时空分辨测量。发表一作及通讯SIC论文60余篇，包括 J. Am. Chem. Soc. (1篇)、Angew. Chem. Int. Ed. (3篇)、Chem. Sci. (3篇)以及Anal. Chem. (20篇)。2013年先后获湖南省科技厅杰出青年科学基金以及教育部新世纪优秀人才支持计划资助；2015年获国家自然科学基金优秀青年科学基金资助，霍英东青年教师奖；2016年入选南开大学百名青年学科带头人培养计划。目前担任《中国化学快报》青年编委。

课题组网址

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