黄硕团队Angew. Chem.：基于纳米孔测序技术的单分子鸟嘌呤烷基化损伤检测及其癌症检测的应用

近年来，癌症已成为危害人类健康最主要的疾病之一。随着组学大数据及生物技术的飞速发展，肿瘤精准医疗也应运而生 ^[1]。肿瘤精准医疗主要在分子水平对易感癌基因的变化（原癌基因或抑癌基因发生的基因突变等）或生物标志物进行检测，利用提取出的生物指标和信息，达到个体化和预见性的治疗^[2]。结肠癌患者体内经常可以检测到一种烷基化鸟嘌呤O⁶-carboxymethylguanine（O⁶-CMG），未来有望作为结肠癌的生物标志物。O⁶-CMG在人体中的含量与加工类（红）肉制品摄入量成正相关，会引起G-A碱基颠换，导致基因的永久性改变^[3]。因此，实现O⁶-CMG在基因上的精准定位十分重要，由此将对人们进一步理解癌症机理、建立肿瘤诊断标志物等方面提供宝贵信息。

然而目前还没有方法能够在基因层面实现O⁶-CMG的直接检测。纳米孔测序技术是新兴的单分子测序方法。原理上说，纳米孔测序技术可以在单分子水平直接读取DNA的碱基序列，且无需基因扩增，是检测修饰碱基最直接的方法^[4]。

近日，南京大学化学化工学院的黄硕教授（点击查看介绍）课题组与瑞士巴塞尔大学化学学院的Dennis Gillingham教授（点击查看介绍）课题组合作，利用纳米孔测序技术实现了对O⁶-CMG的高特异性直接检测。该合作团队通过设计特殊的DNA模式序列，并用化学合成的手段在模式序列的不同位置引入一个或多个O⁶-CMG修饰碱基，进而在纳米孔测序过程中直接观测到O⁶-CMG产生的特异性测序信号。O⁶-CMG在纳米孔测序中表现为极高的测序电流信号，与天然碱基信号显著区分，并借此实现O⁶-CMG在DNA序列中的精准定位。在所展示的实验数据中，O⁶-CMG的单次测序事件识别正确率可高达95%以上，三次重复测序即可达到99.9%以上的Consensus正确率。相比于传统方法而言，该方法具有单分子检测精度，保留了原始碱基上的官能团修饰，同时还能获取O⁶-CMG周围的碱基序列，是目前实现O⁶-CMG直接精准定位的唯一方法。

图1. 人体内O⁶-CMG产生诱因及纳米孔检测O⁶-CMG示意图。左上，人体内源物质（细胞代谢产生的亚硝基化合物）或外源物质（加工类/红肉制品、抗癌药物）会导致人体内产生O⁶-CMG。右上，O⁶-CMG化学式。相较于天然鸟嘌呤，O⁶-CMG 6号氧位置多一个羧甲基取代。下，纳米孔测示意图及测序信号。红色部分是O⁶-CMG产生的特异性信号。

在进一步的实验中，该团队在单分子测序实验中意外发现O⁶-CMG会在单分子水平对phi29 DNA聚合酶产生复制阻碍，具体表现为奇异的动力学特征，这一现象或许可以解释在二代测序过程中出现的扩增偏见及测序盲区等问题。对酶动力学过程进一步挖掘，其中的酶动力学参数有望实现对一系列修饰碱基的深度区分，原则上可以实现对O⁶-CMG等一系列碱基损伤的100%精准分辨。

图2，单分子及宏观水平分别观测到O⁶-CMG是phi29 DNA聚合酶复制障碍。a）利用纳米孔-DNA聚合酶组合研究O⁶-CMG与phi29 DNAP之间的酶动力学过程。b）通过电流信号，首先观测到O⁶-CMG测序信号（红色部分），后续观测到O⁶-CMG是phi29 DNA聚合酶复制障碍。c）b中红色区域放大。d）宏观水平验证O⁶-CMG是phi29 DNA聚合酶复制障碍。利用琼脂糖凝胶电泳，表征phi29 DNA聚合酶对含O⁶-CMG的DNA加合物的延伸结果。

该工作于2019年4月25日发表在Angewandte Chemie International Edition 期刊。其中，南京大学化学化工学院硕士研究生王宇和瑞士巴塞尔大学化学学院博士后Kiran M. Patil为论文的共同第一作者，黄硕教授和Dennis Gillingham教授为论文的共同通讯作者，南京大学为第一通讯单位。

论文主要完成单位黄硕课题组主要从事单分子生物纳米孔器件原创研发与医疗检测应用。近年来，黄硕课题组在该研究领域有多项成果发表，包括开发了一种新型的纳米孔错位测序方法（nanopore-induced phase-shift sequencing, NIPSS, Chem. Sci., 2019, 10, 3110-3117）和新型光学纳米孔技术（Osmosis-Driven Motion-Type Modulation of Biological Nanopores for Parallel Optical Nucleic Acid Sensing. ACS Appl. Mater. Interfaces, 2018, 10, 7788-7797），为纳米孔测序拓展更多应用出口。

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面，或点此查看原文）：

Nanopore sequencing accurately identifies the mutagenic DNA lesion O⁶‐carboxymethyl guanine and reveals its behavior in replication

Yu Wang, Kiran M. Patil, Shuanghong Yan, Panke Zhang, Weiming Guo, Yuqin Wang, Hong-Yuan Chen, Dennis Gillingham, Shuo Huang.

Angew. Chem. Int. Ed., 2019, DOI: 10.1002/anie.201902521

参考文献：

[1] F. S. Collins, H. Varmus, N. Engl. J. Med. 2015, 372, 793-795.

[2]  杭渤, 束永前, 刘平, 魏光伟, 金健, 郝文山, 王培俊, 李斌, 毛建华. 肿瘤的精准医疗肿瘤的精准医疗: 概念、技术和展望[J]. 科技导报, 2015, 33(15): 14-21.

[3] M. H. Lewin, N. Bailey, T. Bandaletova, R. Bowman, A. J. Cross, J. Pollock, D. E. G. Shuker, S. A. Bingham, Cancer Research2006, 66, 1859-1865.

[4] E. A. Manrao, I. M. Derrington, A. H. Laszlo, K. W. Langford, M. K. Hopper, N. Gillgren, M. Pavlenok, M. Niederweis, J. H. Gundlach, Nat. Biotechnol.2012, 30, 349-U174.

导师介绍

黄硕

https://www.x-mol.com/university/faculty/56491

课题组链接

http://hysz.nju.edu.cn/bionano/2.html

Dennis Gillingham

https://www.x-mol.com/university/faculty/63915

课题组链接

https://www.chemie1.unibas.ch/~gillingham/app.php