Angew. Chem.：血红素生物合成途径中SAM自由基酶HemN机制研究新突破

血红素是自然界各生物所共有的辅因子，在重要基础生命活动如呼吸作用、光合作用、氧气传递等都发挥着重要作用，其生物合成途径研究一直受到广泛关注。经典的血红素合成途径均涉及由粪卟啉原III（1）经过迭代的氧化脱羧生成原卟啉原IX（3）的反应（图1）。在有氧途径中，生物利用一类氧气依赖的粪卟啉氧化酶HemF完成这一过程；在无氧环境中，生物发展了截然不同的一套机制，即利用了高活性自由基作为氧化剂来代替氧气发生反应。厌氧粪卟啉氧化酶HemN属于古老的SAM自由基酶（Radical SAM enzymes）家族，其利用四铁四硫簇的还原作用，产生一个高度活泼的脱氧腺苷（dAdo）自由基，从而引后续的化学反应。

图1. 厌氧粪卟啉氧化酶HemN的催化过程

HemN作为SAM自由基家族的重要代表，系列的前期研究已经对其功能及机制有了一个详尽的报道。目前普遍认可的HemN催化过程如下：HemN催化SAM产生dAdo自由基攫取化合物1丙酸侧链β位的一个氢原子，产生的自由基中间体经过脱羧并转移一分子电子，生成乙烯官能团；HemN的活性中心结合有两分子的SAM，机制推测第二个乙烯基团以相似的机制生成，从而消耗两分子SAM，完成这一迭代脱羧过程。

图2. 目前普遍认可的厌氧粪卟啉氧化酶HemN的脱羧机制

HemN作为自由酶，其催化的过程必需受到严格的调控，这就带来了一个疑问：其活性中心的两分子SAM如何通过其唯一的四铁四硫簇的完成这一迭代脱羧过程，这一精准的调控如何实现？带着这一疑问，复旦大学张琪（点击查看介绍）课题组对HemN的催化机制进行了再次的深入研究，对此前普遍接受的机制进行了大大地修正。作者首先合成了甲基被氘标记的d₃-SAM分子，将其用于HemN反应，分析发现与使用常规SAM的反应相比，d₃-SAM分子的反应中相关产物的生成量大幅下降（图3A）。与此同时，液相高分辨质谱（LC-HRMS）对脱氧腺苷分子（dAdoH）检测发现d₃-SAM的反应中生成的dAdoH有比较明显的氘原子标记（图3B）。这一发现表明，在HemN催化的反应中，两分子的SAM有着相互的质子交换过程。随后作者对HemN的反应进行了仔细的分析，发现单脱羧化合物2捕获了一分子的SAM自由基，生了SAM加成化合物5，相似的结果在出现在d₃-SAM反应中（图3C&D）。

图3. HemN催化反应的LC-HRMS分析

该研究发现清晰地揭示了HemN反应的引发机制。与之前认为的直接攫取底物的氢原子不同，HemN活性中心结合的两分子SAM，其中SAM#1被铁硫簇还原生成dAdo自由基攫取SAM#2甲基的一个氢原子，生成的亚甲基自由基分子7去攫取底物丙酸链的β位氢原子，经过这一严格调控的质子传递链，从而完成氧化脱羧反应的引发（图4A）。SAM加成产物5&5D的发现表明HemN催化的第二分子依旧发生在SAM#2的位置，同时单脱羧产物2的发现表明HemN的迭代脱羧是分布式（distributive）的过程，由此作者提出了HemN催化迭代脱羧的过程中单脱羧产物2可以自由进出，（图4B）同时伴随SAM#3的引入，经过严格的质子传递后，引发第二分子的脱羧，生成产物3。该修正的HemN催化机制的提出，再次表明了SAM自由基酶家族对高活性自由基生成及其活性的精准控制，这种链式的传递与控制也展现了自然界精妙的进化之美。

图4. 重新修改的HemN催化新机制

这一研究工作发表于德国应用化学（Angew. Chem. Int. Ed.），复旦大学化学系博士研究生季鑫剑为论文第一作者。

该论文作者为：Xinjian Ji, Tianlu Mo, Wan-Qiu Liu, Wei Ding, Zixin Deng, Qi Zhang

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面，或点此查看原文）：

Revisiting the Mechanism of the Anaerobic Coproporphyrinogen III Oxidase HemN

Angew. Chem. Int. Ed., 2019, DOI: 10.1002/anie.201814708

导师介绍

张琪

https://www.x-mol.com/university/faculty/9703

（本稿件来自Wiley）