DNA的定制合成：波澜不惊的表象与汹涌澎湃的革新

随着纳米技术、生物技术、化学生物学、分子生物学等多学科的交叉融合，利用DNA对纳米材料或是分子进行功能化修饰对于化学研究者而言可以说已经是较为成熟的技术。对于涉及生物医学领域的研究者来说，设计引物更是必须打牢的基本功。对于科研工作者而言，去定制合成一段DNA序列只需要坐在电脑前输入想要的序列，选定购买的量与纯化方式，然后等着实际上送上门就好。DNA的定制合成看上去极其普通平常，都不如点个外卖来的让人纠结（甚至有时价格比一顿外卖还便宜），但是据Nature 的一篇报道 ^[1]，这看上去岁月静好波澜不惊的表面下，新的技术革新正在汹涌澎湃，也许将改变未来科研的面貌。

国内一家大型专业DNA定制合成公司的定制界面，定制DNA可能比叫外卖还快。

为了能够理解这一变革，我们先要了解当前生物公司是怎样合成DNA的。根据各大公司的技术资料显示，目前广泛采用的是一种20世纪80年代开发的被称为“固相亚磷酰胺合成法”的化学合成法。其过程主要包括脱三苯甲基（detritylation）—激活（activation）—偶联（coupling）—加帽（capping）—氧化（oxidation）—脱三苯甲基（detritylation）依次循环，一次循环添加一个碱基，每个碱基都被一个保护基团封端，该保护基团阻止其反应延伸链，直到该封端被移除并添加下一个碱基。由于在固相上进行反应，每添加一个碱基就通过将多余的反应物洗去来控制反应的进程，很容易实现自动化，所以该方法很快就被各大公司采纳，开发了专用的DNA自动化合成仪。

DNA化学合成法的技术流程。图片来源：ATDBio

化学合成的常识告诉我们，既然每添加一个碱基需要这么多的步骤，合成的效率就是必须关注的问题。经过了接近40年的发展，通过使用品质优良的原料以及对生产工艺的优化，每一步添加碱基的成功率已经能够达到99.5%。但是每个加碱基循环0.5%的失败率不容忽视，尤其是这失败率是叠加的，当要合成一段60个碱基的DNA时，成功率就只有74.0%。这就是为什么很多生物公司合成的DNA长度越长，单碱基的费率就越高，且大多不提供超过200个碱基的DNA合成服务，因为其理论成功率不会高于37%，而实际操作中因为各种不可控的因素，几乎无法成功得到想要的DNA分子，这也就是为什么我们很难找到公司愿意合成多于200个碱基的单链DNA。因此，DNA化学合成的致命缺点就是难以合成长链的DNA分子。

当化学方法无能为力时，不少人就想到了“师法自然”，毕竟人类基因组中30亿个碱基对不是天上掉下来的。得益于酶学的发展，核酸扩增技术的发展使DNA、RNA的检测早已不是难题，那么这次生物酶是否能帮助人类完成对DNA的定制合成呢？答案当然是肯定的。

从2018年下半年开始，与DNA的生物合成进展相关新闻频繁出现，很多顶尖研究机构、生物技术巨头参与其中。6月，美国哈佛大学George Church课题组在预印本网站bioRxiv网站上传了一项研究成果 ^[2]，利用模板非依赖性的DNA聚合酶实现DNA的定制化合成，成功合成长度为144个碱基的DNA。两个月后，总部位于美国加州的生物技术公司Molecular Assemblies宣布利用与Church相似的技术取得了DNA生物合成的突破。7月，加州大学伯克利分校的Jay Keasling生物合成实验室发表了一篇Nature Biotechnology^[3]，利用模板非依赖性的DNA聚合酶实现DNA的从头合成（De novo synthesis），且每添加一个碱基耗时10-20 s，并很快宣布与Ansa Biotechnologies展开合作推广该技术的商业化。10月，法国巴黎的生物技术公司DNA Script宣布成果利用生物酶合成法定制合成了150个碱基的DNA分子，并且测序显示成功率“让人非常满意”。很快，英国剑桥的两家公司，Nuclera Nucleics 与Evonetix，也公布了相关计划，开发DNA生物合成技术。目前为止尚未有国内生物技术公司公布该领域的研究计划。

末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）的结构。图片来源：J. Mol. Biol. ^[4]

基于TdT的DNA生物合成方法示意图。图片来源：Nat. Biotechnol. ^[3]

以上所有技术的核心就是来源于免疫细胞的一种称为末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）的DNA聚合酶。与大多数DNA聚合酶不同，TdT可以在没有模板的情况下工作，在DNA分子的末端随机添加新的碱基。该技术的难点就是怎么解决“随机”添加碱基的问题，让每次都添加上需要添加的碱基。在这个问题上，不同的研究组选择了不同的思路。Ansa Biotechnologies选择将每个要添加的碱基连接在TdT上，这样每次添加一个碱基后TdT就被共价结合在DNA的3’末端，使TdT无法再继续随机添加碱基，然后再通过剪切、洗去、再添加的方法依次合成。而其它大部分研究组则选择利用生物技术改在TdT酶，或者对修饰碱基单体进行修饰，使每添加一个碱基后反应能够自然停止，直到加入新的反应物。

显然，用生物合成的方法来定制DNA仍然处于起始阶段——拥有多年DNA合成经验的巨头们都在合成策略上有所分歧。但是这是一个巨大的市场，因为DNA的生物合成一旦实现，将极大拓展DNA分子的应用范围。目前DNA化学合成的市场大约每年10亿美元，而一旦能够合成更长链的DNA，将使市场拓展到生物信息储存领域，产生140亿美元的潜在增长。更重要的是，该技术将推动合成生物学的进步，使人类能够设计与构建基因组数据库，生命科学研究可能将从改造发展到创造。虽然目前DNA的生物合成不论是准确度、速度、还是合成长度都还无法比肩化学合成，但是我们无法预估它的未来——就像我们不能小瞧任何一个襁褓中的婴儿一样。

参考文献：

1. The race for enzymatic DNA synthesis heats up. Nature, 2019, 566, 565, DOI: 10.1038/d41586-019-00682-0

https://www.nature.com/articles/d41586-019-00682-0

2. Enzymatic DNA synthesis for digital information storage. Preprint at bioRxiv, DOI: 10.1101/348987

https://www.biorxiv.org/content/10.1101/348987v1

3. De novo DNA synthesis using polymerase-nucleotide conjugates. Nat. Biotechnol., 2018, 36, 645-650, DOI: 10.1038/nbt.4173

https://www.nature.com/articles/nbt.4173

4. J. Mol. Biol., 2013, 425, 4334–4352, DOI:

https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0022283613004415

（本文由BingzzZ供稿）