快速、准确、经济：CRISPR技术在疾病检测中的崛起

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近日，Nature新闻版块报道了基于基因编辑技术开发了可用于拉沙热等疾病早期诊断的方法，这有助于控制这些烈性传染病的传播。

拉沙热(Lassa fever)是在尼日利亚、几内亚、利比里亚和塞拉利昂等西非地区流行的一种人畜共患疾病，是由拉沙热病毒（沙状病毒科，单链RNA病毒）引起的，感染后病程1-4周；该病毒因其治疗难度和传染性被评为危险等级最高的病毒（生物安全第四级：给人类造成致命的疾病，并且在绝大多数的情况下是不可救治的，最著名、危害最大的病毒要数埃博拉病毒Ebola和拉沙病毒Lassa）。

快速、准确且经济是对理想诊断方式的基本要求，此外还应该兼顾操作的简便性（操作不需要专业人员、简单培训即可）、尽量避免专业设备和过强的基础设施要求（如电力条件等）。因为埃博拉病毒（Ebola virus）、拉沙病毒（Lassa virus）等疫情常常在偏远地区爆发，如果有理想的诊断技术，便可尽早发现患者，然后将其隔离治疗，避免疫情的扩散。因此，快速、准确地诊断传染性疾病是防控重大疫情传播的关键。

CRISPR分子诊断技术的开发

麻省理工学院(MIT)和哈佛的Broad Institute的张峰团队正在努力开发CRISPR- Cas13分子诊断技术 。Cas13蛋白不像用于基因编辑的Cas9蛋白，它在切割靶序列后会不加选择地切割碰到的RNA（collateral cleavage）；这一特性使其不能被用于基因编辑，但对诊断来说却是个福音，该切割能增加检测信号的灵敏度。2018年，他们把这种诊断技术命名为SHERLOCK（Specific High-Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOKing）【1】，该系统包含Cas13、对应的靶向待检测病毒的sgRNA和包含一个切割后可发出荧光的报告RNA链；当这些Cas13蛋白识别到靶向RNA链时会切割相应的模板，随后激活了它的collateral cleavage活性，进而切割报告RNA并释放可检测的荧光信号（图1）。

图1 SHERLOCK技术示意图

张锋团队在升级后SHERLOCKv2系统中增加了Cas蛋白的种类（LwaCas13a 、PsmCas13b、CcaCas13b 和AsCas12a）【2】，这样可以同时检测到四种病毒（图2）；并利用CRISPR type-III中的Csm6酶（重新设计RNA的报告序列，使其被Cas13剪切的末端序列为2’,3’-环磷酸的线性腺苷酸，从而激活Csm6的酶活）放大其检测信号，进一步增强了使得该方法的灵敏度。CRISPR分子诊断技术的检测精度有望跟传统的检测方法一样，而使用方法跟家庭验孕棒一样简单（图3）。CRISPR系统只要设计好特异的sgRNA就可以靶向特定的核酸序列，研究人员希望能在一周内鉴定出病毒爆发区域的任何毒株。

图2 SHERLOCKv2同时检测四个靶点

图3 SHERLOCK检测结果

加州大学伯克利分校的Doudna团队发现当Cas12a蛋白在剪切靶向的dsDNA 后能高效地切割非特异性单链 DNA（ssDNA），基于此开发了DETECTR（DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter）技术（图4）【3】； 该系统包含Cas12a、靶向特定序列的sgRNA和非特异性 ssDNA 荧光报告序列（FQ-labeled reporter）。一旦Cas12a检测到目的 DNA序列便会切割靶序列，接着荧光报告序列也会被切割，从而释放出荧光信号。DETECTR 技术可以准确地检测出是否有高危型HPV病毒感染：HPV16（100%）、HPV18 （92％）。DETECTR测试单次成本不到一美元，只需一个小时；该技术具有快速、准确、易用的特点，尤其适合HPV的大规模普查。“这是CRISPR领域特别令人兴奋的方向”， 加州大学伯克利分校的生物化学家Jennifer Doudna说。

图4 DETECTR技术应用示意图

Doudna希望这项技术能帮助非洲国家遏制宫颈癌死亡人数的上升，这些国家的宫颈癌患者无法治疗常常是因为确诊太晚。去年，她在旧金山与人共同创立了公司（Mammoth Biosciences，获得2300 万美元 A 轮融资），想进一步发展这种诊断方法；她们正在用加州人的血液样品进行HPV病毒的检测。此外，她们还想把新发现蛋白尺寸更小的Cas14和CasX蛋白用于诊断技术中【4，5】，更加丰富了CRISPR分子诊断的相关技术。

值得一提的是中科院上海植物生理生态研究所赵国屏院士团队王金博士也发现了Cas12a对于靶标ssDNA和非靶标ssDNA的切割特性，相关工作发表在Cell Research杂志上（详见BioArt：一个悲喜参半的故事丨植生所王金博士等报道Cas12a对于靶标ssDNA和非靶标ssDNA的切割特性研究）。基于该原理，研究团队也开发了核酸快速检测体系，相关工作正在投稿中。

CRISPR分子诊断技术在疫情地区的应用

研究团队正在尼日利亚测试这种新型的CRISPR分子诊断技术对拉沙病毒检测的准确性如何（图5），并将检测结果跟实验室传统的方法PCR这类诊断金标准进行对比。最终发现SHERLOCK检测技术的费用是传统PCR检测方法的一半，并且节约了一半的时间（从4个小时缩短到2个小时）。虽然两种诊断方法处理样品时均需要电力，但断电对SHERLOCK技术的影响不像PCR技术那么大，而在尼日利亚经常发生断电。如果该方法最终能被应用于病毒爆发的地区，这将有助于早期检测出病毒感染者，从而提高患者治疗的疗效，进而遏制病毒的广泛传播。

图5 尼日利亚研究人员正在使用CRISPR分子诊断试剂检测血液样本中是否含有拉沙病毒

尼日利亚的分子生物学家Jessica Uwanibe说，可靠、易用的拉沙病毒检测技术能减少高达60%拉沙热患者的死亡，这是一项可以挽救很多人性命的事业。

洪都拉斯和美国加州的科学家正在用CRISPR介导的分子诊断技术测试登革热病毒（dengue viruses）、寨卡病毒（Zika viruses）和人类乳头瘤病毒（HPV）的检出效率；而在刚果民主共和国CRISPR分子诊断技术被用于埃博拉病毒（Ebola virus）的检测。

不可忽视的市场力量

世界卫生组织驻尼日利亚技术官员Dhamari Naidoo说：“这些事非常令人兴奋的创新，” 但她补充道，如果想让CRISPR分子诊断技术在低收入国家中产生足够的影响，研究人员必须确保该技术的授权、制造和价格等这些国家能负担得起。

Naidoo说，研究人员常常忽视那些因素，比如各国研究人员大约开发了12种埃博拉病毒（Ebola）的诊断试剂，但只有2种试剂能在刚果（金）埃博拉疫情爆发后应用。其余的均因经济原因受阻，如试剂的市场容量不足抵消制造和分销这些产品的成本。

由于伯克利和Broad之间仍存在专利之争，从经济角度来看基于CRISPR的分子诊断技术可能尤其麻烦。但Doudna和Pardis Sabeti（SHERLOCK项目负责人之一）两个团队均表示她们正致力于授权这些工具，以确保需要这些分子诊断工具的人们能够使用。

对Uwanibe来说这一天来得还不够快，她说“这一天我希望我们能更尽早的实现。”

原文链接：

https://www.nature.com/articles/d41586-019-00601-3

1.    Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Lee JW, Essletzbichler P, Dy AJ, Joung J, Verdine V, Donghia N, Daringer NM, Freije CA et al: Nucleic Acid Detection with CRISPR-Cas13a/C2c2.SCIENCE2017, 356,438-442.

2.    Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Kellner MJ, Joung J, Collins JJ, Zhang F: Multiplexed and Portable Nucleic Acid Detection Platform with Cas13, Cas12a, and  Csm6.SCIENCE2018, 360,439-444.

3.    Chen JS, Ma E, Harrington LB, Da CM, Tian X, Palefsky JM, Doudna JA: CRISPR-Cas12a Target Binding Unleashes Indiscriminate Single-Stranded DNase Activity.SCIENCE2018, 360,436-439.

4.    Harrington LB, Burstein D, Chen JS, Paez-Espino D, Ma E, Witte IP, Cofsky JC, Kyrpides NC, Banfield JF, Doudna JA: Programmed DNA Destruction by Miniature CRISPR-Cas14 Enzymes.SCIENCE2018, 362,839-842.

5.    Liu JJ, Orlova N, Oakes BL, Ma E, Spinner HB, Baney K, Chuck J, Tan D, Knott GJ, Harrington LB et al: CasX Enzymes Comprise a Distinct Family of RNA-guided Genome Editors.NATURE2019, 566,218-223.