JACS：“FP tag”，基于荧光偏振的高通量糖基转移酶活性测试方法

糖基化是受体分子，例如蛋白质、核糖、脂等分子，在糖基转移酶（Glycosyltransferases）的作用下连上糖类分子的过程。人类基因组中存在大约250到500个和糖基化相关基因，约占人类基因组1-2%。糖基化就像磷酸化一样，是一种重要的翻译后修饰（post-translational modifications），可以影响蛋白质的生理活性，在细胞识别、受体活性、信号传递等过程中发挥着重要的作用。许多传染性疾病、免疫性疾病、代谢性疾病以及癌症的发展过程中均伴随着蛋白糖基化异常的发生。所以高通量筛选糖基转移酶抑制剂具有重要的意义。

近日，加拿大英属哥伦比亚大学Steve Withers 课题组发展了名为“FP tag”的基于荧光偏振相对比较通用的高通量糖基转移酶活性测试方法。此方法借鉴了Paulson课题组发展的基于荧光偏振的高通量筛选唾液酸糖基转移酶、岩藻糖糖基转移酶抑制剂的方法（Angew. Chem. Int. Ed., 2011, 50, 12534-1253，图1A）。小分子荧光基团在溶液中转动很快，用偏振激发光照射小分子荧光基团时，其发射光在其激发光的角度上的荧光信号比较弱，荧光偏振信号很弱。而溶液中的大分子，例如蛋白质和酶，转动通常比较缓慢，若用偏振激发光照射连接着大分子的荧光基团时，其发射光将在其激发光的角度上保持很大的荧光强度，荧光偏振信号很强。利用此现象，Paulson课题组首先将荧光基团连接到了唾液酸CMP和岩藻糖UDP上，之后用唾液酸糖基转移酶、岩藻糖糖基转移酶将荧光基团标记的糖供体分别转移到去唾液酸胎球糖蛋白和胎球糖蛋白上。此过程将小分子荧光基团转移到了大分子胎球糖蛋白上，产生了较大的荧光偏振信号的变化。但是由于受体蛋白的的限制，此方法只能用于唾液酸糖基转移酶、岩藻糖糖基转移酶。Withers课题组设想可以将受体通过生物素连接到大分子链酶亲和素上，链酶亲和素可以“代替”胎球糖蛋白，作为可以增强荧光偏振信号的“FP tag”（图1B）。理论上“FP tag”方法可以应用于任何糖基转移酶：只要将糖基转移酶的供体连上荧光基团，将糖基转移酶的受体连接到“FP tag”上，就可以利用偏振信号增强来监测糖基转移酶的活性。

图1. A) Paulson课题组发展的高通量筛选唾液酸糖基转移酶和岩藻糖糖基转移酶抑制剂的方法。B) Withers课题组发展的“FP tag” 高通量筛选糖基转移酶抑制剂的方法。

细菌荚膜多糖（bacterial capsular polysaccharides, CPS）是一种重要的毒力因子。许多革兰氏阴性致病菌的CPS都含有3-去氧-D-甘露-2-辛酮糖酸（β-Kdo）。而β-Kdo糖基转移酶是一类新的糖基转移酶家族，和其他家族的糖基转移酶的相似度很低，所以是一种具有吸引力的抗毒力因子的靶点。Withers课题组首先将“FP tag”方法应用于β-Kdo 糖基转移酶，但在这个过程中遇到了不少的困难。首先糖供体Kdo-CMP 在溶液中不稳定，所以实验中的Kdo-CMP只能原位（in situ）形成，增加了高通量筛选的难度。再者，不同于唾液酸糖基转移酶、岩藻糖糖基转移酶，β-Kdo糖基转移酶的底物专一性非常高，无法接受荧光基团修饰的糖供体。但是作者发现β-Kdo糖基转移酶可以接受叠氮修饰的糖供体。所以作者最终通过两步法进行高通量筛选：先把原位形成的N₃KdoCMP连接到糖受体-荧光基团上，反应一段时间后，加入DBCO-biotin-Streptavidin的混合物，利用点击反应连接上“FP tag”。通过此方法，作者筛选了1000多个海绵粗提物，并通过活性追踪的方法，发现了两个可以作为β-Kdo 糖基转移酶抑制剂的海洋天然产物：aeroplysinin-1 (IC₅₀ = 7.9 μM)和verongiaquinol (IC₅₀ = 3.3 μM)。

图2. 糖基转移酶抑制剂筛选

这项工作对发展的抗毒力因子药物具有一定的意义，但更重要的“FP tag”方法有可能应用于其他糖基转移酶的抑制剂的高通量筛选。

这一成果近期发表在JACS 上，文章的第一作者（共同通讯作者）是中山大学海洋学院的高志增副教授。

该论文作者为：Zhizeng Gao, Olga G. Ovchinnikova, Bo-Shun Huang, Feng Liu, David E. Williams, Raymond J. Andersen, Todd L. Lowary, Chris Whitfield, Stephen G. Withers

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High-Throughput “FP-Tag” Assay for the Identification of Glycosyltransferase Inhibitors

J. Am. Chem. Soc., 2019, DOI: 10.1021/jacs.8b10940

导师介绍

高志增，加拿大阿尔伯塔大学博士毕业，导师John Vederas，主要从事天然产物生物合成的研究，在JACS、Nature Chem Bio 等期刊上发展论文多篇。之后加入加拿大英属哥伦比亚大学Steve Withers 教授组，进行博士后工作，主要从事糖化学生物学研究。在博后期间发展了多种流感病毒神经氨酸酶荧光探针（Angew 2017, Angew 2018）。之后发展了“FP tag”高通量糖基转移酶活性测试方法，并通过高通量筛选发现了两个海洋来源的β-Kdo糖基转移酶抑制剂。之后又和加拿大医药研究中心（CDRD）合作，筛选了一个包含15万化学物的商业化合物库，找出多个β-Kdo糖基转移酶抑制剂。2018年，加入中山大学海洋学院，主要从事糖化学生物学、海洋天然产物基因挖掘、生物合成方面的研究。现在课题组招聘具有有机合成、糖化学生物学、天然产物、分子生物学、化学生物学等背景的博士后和专职科研人员多名，如有意向，请发简历至gaozhizeng@mail.sysu.edu.cn。