张峰团队这次慢了一步丨第三种可以编辑人类细胞基因组的CRISPR-Cas系统

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核心提示：一个多月前，中科院动物所李伟研究组率先报道了第三个可以编辑人类细胞基因组的工具Cas12b。

CRISPR-Cas系统为细菌和古菌抵抗外界病毒入侵的适应性免疫，基于此已开发出了两套基因编辑系统： CRISPR-Cas9和CRISPR-Cas12a（Cpf1）。它们能有效地编辑动植物的基因组，极大地推动了基因编辑相关领域的发展【1】。但Cas9系统存在脱靶效应、Cas9和Cas12a蛋白的尺寸太大，是否能找到尺寸更小、特异性更高的效应蛋白对整个基因编辑领域意义重大，尤其是治疗性基因编辑方面的应用。

北京时间1月23日，来自MIT的张峰团队在Nature communication上发表了题为Engineering of CRISPR-Cas12b for human genome的研究论文，开发了第三种基因编辑工具CRISPR-Cas12b，该工具经过改造后也能在哺乳动物和人体中进行有效的基因编辑。

早先报道核酸酶(AacCas12b)保持体外切割活性的温度范围是40℃至55℃，这不适合于哺乳动物基因组编辑【2】。研究人员用BLAST找出了27个V–B型的Cas12b蛋白，排除了来源于嗜热菌和先前研究过的还剩14个候选者，最终发现四个Cas12b(AkCas12b、BhCas12b、EbCas12b、LsCas12b)可能有活性。体外实验表明，AkCas12b和BhCas12b在37℃仍具有较强的DNA切割活性，把tracrRNA和crRNA融合成一个sgRNA后也能保持切割活性。

三种基因编辑工具：Cas9、Cas12a（Cpf1）和Cas12b

有意思的是，这两个核酸酶在细胞系也能检测到切割活性，虽然插入缺失突变的比例不到1%。为了提高在细胞内的切割效率，研究人员首先优化了相应的sgRNA序列，发现BhCas12b的切割活性提高了30倍。研究人员进一步发现AkCas12b和BhCas12b倾向于在DNA非靶向链上产生缺口，提示可能是由于Cas12b结构比较紧凑，影响了靶向链进入RuvC活性中心。AacCas12b与DNA复合物的晶体结构揭示了RuvC活性中心与DNA底物互作的关键氨基酸。为了提高BhCas12b与DNA的亲和力和切割活性，作者测试了176个突变体，发现K846R 和S893R能显著提高切割活性。

适冷酶表面富含甘氨酸，这增加了蛋白的柔性和酶活【3】。为了进一步提高BhCas12b的酶活，研究人员测试了66个BhCas12b表面的氨基酸替换成甘氨酸突变体的酶活，发现突变体E837G（位于gRNA:DNA 双链和RuvC活性中心之间）能至少提高两倍的酶活。

综上，研究人员构建了酶活最高的突变体BhCas12b v4（K846R/S893R/E837G），它有以下几个优点：（1）酶活与SpCas9、AsCas12a相当，但特异性比更SpCas9更高，其安全性更适合于临床应用；（2）在基因组里PAM数量与AsCas12a相当，扩大了基因组的靶向范围；（3）蛋白更小（BhCas12b：1108个氨基酸、SpCas9：1369个氨基酸、AsCas12a：1353个氨基酸），尤其适合用于腺相关病毒AAV介导的基因治疗。因此，该系统具有极大的应用前景，有望开发出新一代安全高效的基因编辑工具。

特别值得一提的是，不久前（2018年11月27日）来自中科院动物所李伟课题组在Cell Discovery杂志上发表了题为Repurposing CRISPR-Cas12b for mammalian genome engineering的相似研究成果，同样鉴定出了一个名为Cas12b（又称为C2c1）的新CRISPR系统，能够编辑人类细胞基因组并应用于制备动物疾病模型【4】。据悉，针对这项新技术，该研究团队已于一年前提交了专利申请，并正在开发这项技术在基因治疗中的应用。

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41467-018-08224-4

https://www.nature.com/articles/s41421-018-0069-3

参考文献：

1. Hsu PD, Lander ES, Zhang F: Development and Applications of CRISPR-Cas9 for Genome Engineering.CELL2014, 157,1262-1278.

2. Shmakov S, Abudayyeh OO, Makarova KS, Wolf YI, Gootenberg JS, Semenova E, Minakhin L, Joung J, Konermann S, Severinov K et al: Discovery and Functional Characterization of Diverse Class 2 CRISPR-Cas Systems.MOL CELL2015, 60,385-397.

3. Mavromatis K, Tsigos I, Tzanodaskalaki M, Kokkinidis M, Bouriotis V: Exploring the Role of a Glycine Cluster in Cold Adaptation of an Alkaline Phosphatase.Eur J Biochem2002, 269,2330-2335.

4. Teng, F., Cui, T., Feng, G., Guo, L., Xu, K., Gao, Q., ... & Li, W. (2018). Repurposing CRISPR-Cas12b for mammalian genome engineering. Cell discovery, 4(1), 63.