糖胺聚糖的化学酶法合成

糖胺聚糖（GAGs）是一类结构复杂的多分散性杂共多糖家族（图1），具有结构相似、长度不均一、修饰基团多样等特点，根据其二糖重复单元、糖苷键、硫酸化位点的不同可以分为透明质酸（HA）、硫酸乙酰肝素（HS）和肝素（Heparin）、硫酸软骨素（CS）和硫酸皮肤素（DS）、硫酸角质素（KS）四大类。GAGs广泛存在细胞中，既有游离状态也有与核心蛋白结合成糖蛋白的形式，因此在细胞间相互作用、细胞增殖、酶抑制、生长因子受体活化等方面有重要作用，广泛用于临床药物、保健品等。

图1. 糖胺聚糖的二糖结构单元。图片来源：Acc. Chem. Res.

糖胺聚糖的三个传统来源是动物组织提取、化学合成和酶法合成。由于糖胺聚糖的结构相似性和长度多样性，动物组织提取过程中分离纯化困难且有病毒、微生物污染的风险。2007年在美国曾爆发过肝素污染危机，造成了200多人死亡，其原因则是不法商家偷梁换柱，在猪肠提取的肝素中混入了过硫酸化硫酸软骨素。化学合成虽有精准控制的优点，但是合成步骤多、得率低、成本高。以FDA批准的抗凝血药磺达肝癸钠（Arixtra®）为例，其化学合成需要60步且得率仅有0.1%。传统酶法合成巧妙利用了酶催化良好的区域选择性和立体选择性，但目前还无法精确控制反应起始和终止。化学酶法将化学合成的灵活性和酶催化反应的高效性结合了起来，使合成效果事半功倍。目前化学酶法合成糖胺聚糖有半合成和全合成两种策略（图2）。

图2. （A）半合成和（B）全合成化学酶法构建糖胺聚糖。图片来源：Acc. Chem. Res.

为了实现快速精准合成结构明确、长度均一的安全糖胺聚糖，南京师范大学张幸副教授、黄和教授和伦斯勒理工学院Robert J. Linhardt课题组近年来发展了一系列策略，在GAGs合成上实现了较大的突破和成就（图3），并于近期将化学酶法合成糖胺聚糖的工作进展发表在Acc. Chem. Res.上。这篇综述系统而详细地阐述了化学酶法合成糖胺聚糖过程中所需要的酶、受体、供体以及合成时的控制方法，同时也介绍了运用一锅多酶法、非天然UDP-糖供体、重肝素、Smith和碱性降解以及固相合成的新策略新手段取得的进展。

图3. 化学酶法合成糖胺聚糖的应用前景。图片来源：Acc. Chem. Res.

化学酶法合成过程中所需要的酶

糖胺聚糖的化学酶法合成策略包括糖链的延长和糖链的修饰，因此糖基转移酶和用来修饰糖链的酶在化学酶法合成过程中非常重要。

表1. 化学酶法合成糖胺聚糖的常用酶。图片来源：Acc. Chem. Res.

糖基转移酶

不同来源的糖基转移酶能模仿生物体内合成GAGs的糖基化过程。如表1所示，HS和肝素的化学酶法合成过程中常用的酶是KfiA、KfiC和PmHSs，KfiA是从大肠杆菌K5菌株（E.coli K5 strain）中筛选出来的，能将GlcNAc残基转移到HS主链，PmHSs来源于巴斯德氏菌（Pasteurella multocida），能以UDP-GlcNAc和UDP-GlcA为原料合成HS主链。此外，作者还列举了用于合成HA的PmHAS和用于合成CS的KfoC和PmCS等。

糖链修饰酶

在化学酶法合成过程中，磺基转移酶可以利用天然磺基供体3'-磷酸腺苷-5'-磷酸硫酸盐（PAPS）来修饰GAG寡糖和多糖，具有良好的区域专一性。其中，HS 2-OST能将葡萄糖醛酸残基或艾杜糖醛酸残基的2-O-位进行硫酸化，但在艾杜糖醛酸中效果更好。此外还有3种HS 6-OST酶亚型、7种HS 6-OST酶亚型、N-硫酸转移酶（NST）以及N-去乙酰酶（ND）等在不同情况下有不同的应用。在HS或肝素合成过程中，还有一种很重要的酶是C5-差向异构酶（C5-epi），它能够将葡萄糖醛酸异构化成艾杜糖醛酸。

化学酶法合成过程中所需要的构成单元

图4. 糖基化反应中典型的受体（A）和供体（B）。图片来源：Acc. Chem. Res.

受体

在GAGs的全合成过程中，尤其是合成在HS和肝素时，一些单糖和二糖衍生物受体极大地促进了化学酶法合成的发展。作者介绍了三种常见受体：葡萄糖醛酸(1→4)脱水甘露糖（图4A，1）、β葡萄糖醛酸衍生物（图4A，3）、N-乙酰基-α-D-葡糖胺-O-甲基糖苷（图4A，2）。葡萄糖醛酸(1→4)脱水甘露糖能够通过进一步修饰在还原端引入一个可进行点击反应的叠氮基或者氨基，但疏水性发色团的缺少限制了其应用。β-葡萄糖醛酸衍生物的还原端有一个可紫外检测的对硝基苯酚类基团（рNP或pNA-N₃），同时，这两者因为具有强UV吸光度和高C-18结合亲和力而易于分离和纯化，但对硝基苯基的潜在毒性使得其在临床中的应用受限。N-乙酰基-α-D-葡糖胺-O-甲基糖苷是合成商品磺达肝癸钠的一种无毒性受体，可引入氟固相合成技术来促进分离纯化，但大尺寸的含氟基团阻碍了酶的识别和结合。

供体

尿苷二磷酸（UDP）单糖是最常见的供体，能在糖基转移酶或合成酶作用下被转移到糖基受体上，可以通过化学法、酶法或化学酶法来合成，被分为天然供体和非天然供体两大类。作者阐述了几种常见供体的合成方法及应用（图4B）。

天然糖基供体。UDP-GlcA、UDP-GalNAc、UDP-Gal三种供体可以通过各种酶来合成，并且分别用来合成HS/HA、CS/DS、KS。

非天然糖基供体。UDP-三氟乙酰基葡萄糖胺（UDP-GlcNTFA）能在KfiA或PmHS2酶的作用下与UDP-GlcA连成糖主链，然后在弱碱性条件下去掉三氟乙酰基，在NS酶作用下进行磺基化修饰，得到需要的HS或肝素。此外，还有用荧光基团、氟化物修饰的糖以及用叠氮基修饰的UDP糖如UDP-6-N₃GlcNAc、UDP-4-N₃GlcNAc和UDP-4-N₃GalNAc。

化学酶法实现产物精确合成

仔细精确设置化学合成和酶法合成的步骤对目的产物的获得至关重要。作者介绍了两种在合成时常用的控制方法，一是通过控制酶的使用顺序（图5A），二是使用不同亚型的酶（图5B），通过一步步精密设计的步骤可以得到所需的GAGs。

图5. 化学酶法的可控合成。（A）C5消旋；（B）糖链3-O-硫酸化。图片来源：Acc. Chem. Res.

化学酶法合成新策略介绍

在阐述化学酶法合成的基本原理、主要原料之外，作者还介绍了化学酶法合成GAGs的新技术新手段。

一锅多酶法

图6. 一锅多酶法合成肝素寡糖。图片来源：Acc. Chem. Res.

由于糖基供体成本较高，可以廉价单糖为起始原料，在多种酶的共同作用下合成所需的GAGs，如图6所示是以三氟乙酰基葡萄糖胺为供体合成了HS二糖衍生物。这种一锅多酶策略在降低成本的同时也省去了中间产物分离纯化的步骤，大大节省了人力物力。

非天然UDP-糖供体的应用

图7. 非天然糖基供体合成新颖的糖胺聚糖。图片来源：Acc. Chem. Res.

同所有酶催化反应一样，在使用天然UDP-糖为供体酶法合成GAGs时，我们很难像控制化学反应一样精确把握反应的开始与结束。作者介绍了以非天然UDP-糖为供体，得到了均一性可控的GAGs寡糖或多糖，也便于对GAGs进行进一步修饰来获得各种衍生物。例如图7是以UDP-GlcNTFA为供体合成了非还原端含叠氮基或氟的GAGs寡糖或多糖。此外，这种非天然寡糖还可以避免乙酰肝素酶和溶酶体降解酶的作用，大大延长了GAGs药物的生物半衰期。

重肝素的合成及应用

图8. 化学酶法合成全氘代的重肝素。图片来源：Acc. Chem. Res.

作者还介绍了一种稳定的同位素标记的肝素的合成方法，该方法以在同位素环境中培养的微生物合成的氘化肝素前体为起始原料，经过一系列化学和酶法修饰得到了氘化肝素，也叫重肝素（如图8）。这样稳定的同位素标记便于追踪代谢途径、改善药理特性，在非放射性NMR检测和半衰期无背景测量等方面有重要应用。

Smith降解和碱性降解的应用

图9. 碱法选择性裂解肝素寡糖。图片来源：Acc. Chem. Res.

Smith降解和碱性降解是常见且操作简单的化学降解方法，Linhardt课题组首次利用这两种降解方法除去人工合成的GAG糖末端的非天然对硝基苯酚基团，而且在降解过程中没有硫酸根基团裂解。图9介绍了用这种降解方法除去了人工合成的肝素十一糖末端的有毒性的对硝基苯酚，得到了天然结构的肝素九糖。

固相合成

固定化使得连续反应的进行和酶的可重复使用成为可能，Linhardt课题组在这一方面也有所突破。作者简要介绍了固定糖原料便于酶修饰以及固定酶维持酶活性、实现酶重复利用的进展。

历史和展望

在过去五年，GAGs多糖的化学酶法合成在更高的得率和纯度、更简单的纯化方法、更大的规模、结构更复杂的目标物以及对GAG生物合成的底物特异性的理解等方面有了很大的进展，同时也推动了重组酶和细胞代谢工程学的发展。作者在文末表示，尽管目前还存在难以规模化生产等挑战，化学酶法合成策略在提供临床上新型、安全的改良药物方面仍然有着巨大前景。

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Chemoenzymatic Synthesis of Glycosaminoglycans

Xing Zhang, Lei Lin, He Huang*, Robert J. Linhardt*

Acc. Chem. Res., 2020, DOI: 10.1021/acs.accounts.9b00420

（本文由传光簇供稿）