核内“液-液相分离”对染色质结构的感知与重塑

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Cliff Brangwynne (Princeton & HHMI) 1: Liquid Phase Separation in Living Cells.图片引自：https://www.youtube.com

生物大分子的相变/相分离是近年来飞速发展的热门领域。自2009年德国马普所Tony Hyman教授与其博后Cliff Brangwynne发现线虫中的P.granules 实际上是蛋白质聚集形成的“液-液相分离”现象以后，科学家们逐渐发现细胞内的许多无膜细胞器——核仁、Cajal bodies、stress granules、miRISC，及突触的细胞骨架——都是特定的蛋白质/RNA的相变【1】。相变现象如此之普及，而促使液滴成核、生长的物理作用力为何，相变是否影响染色质结构，这些基本的问题尚未得到解决。

Cliff Brangwynne，2007年哈佛大学博士学位，2011年加入普林斯顿大学，现为化学与生物工程副教授，2018年入选为HHMI研究员。图片引自：https://www.princeton.edu/news/2018

2011年，Cliff Brangwynne在普林斯顿大学成立了自己的实验室，仍将研究重点集中于相分离现象及其机制上，并开发了一套能够在活细胞内发现、控制、调节“相分离”的方法。2017年，Brangwynne组在Cell上发表论文构建了一个光控的系统（OptoDroplets，下图）用于研究细胞内的相变过程【2】。

Light-Activated optoDroplets

在上述系统基础之上，Brangwynne组又设计了CasDrop系统（下图）。该体系由三个组分构成：SunTag标记的dCas9蛋白用于将体系锚定到特定的基因位点【3】；scFv标记的sfGFP和iLID融合蛋白用于构建光敏的多聚体；以及sspB标记的目的蛋白IDR(intrinsically disordered regions,IDRs)区域。在表达sgRNA的情况下，scFv-GFP-iLID蛋白被SunTag募集到SunTag-dCas9结合的基因位点处，由于一个SunTag可以结合24个scFv，故此处形成dCas9-ST-GFP-iLID蛋白的多聚体foci；在不表达sgRNA的情况下，dCas9-ST-GFP-iLID蛋白在胞内则成弥散状，在蓝光刺激下，sspB结合到iLID上，目的蛋白IDR相分离使得蛋白多聚，形成foci。该体系可以定量、定位地研究多种蛋白的相分离现象。

CasDrop系统

11月29日，Cell杂志在线发表了Cliff Brangwynne课题组利用CasDrop体系的最新研究成果Liquid Nuclear Condensates Mechanically Sense and Restructure the Genome（DOI：https://doi.org/10.1016/j.cell.2018.10.057）。该研究表明，细胞核内的“液-液相分离”现象能够感知并重塑染色质结构。

作者主要研究了FUS、BRD4、TAF15三个蛋白，三者均能在CasDrop体系的诱导下形成核内“液-液相分离”现象，且BRD4△N形成液滴的能力最强。在不表达sgRNA的情况下，作者发现BRD4△N更倾向于在染色质结构疏松处形成液滴。荧光共定位实验发现，液滴形成处的H2B-miRFP670的荧光强度有显著下降，提示相分离易发生在染色质密度较低的区域。随着液滴的增长，液滴所在区域的染色质会被进一步“推出”该区域，表现为H2B-miRFP670在相变处的荧光强度随时间延长而逐步下降。

内源/合成的IDR所致相变均发生在染色质密度较低的区域，且随液滴增长，相变区域的染色质密度进一步降低

与此现象相符的是，细胞内核仁、Cajal body、PML body、亚细胞核（nuclear speckles）等无膜结构细胞器也倾向于在染色质密度较低处形成（下图）【4】。

随后，作者对相变形成的物理机制进行了详细探讨。作者以公式的形式描述了“液-液相分离”的液滴与可变形的染色质间的相互作用，液滴成核时的自由能损耗△F可通过下式描绘：

该公式说明较小的液滴在染色质密度高或低的区域均可以形成；而当液滴达到光学可分辨的大小时，则倾向于在机械上较软的区域(mechanically soft area)即染色质低密度区形成。

此外，该公式还推测：在染色质密度足够的区域，机械变形能将限制液滴的大小在一个临界值以下。作者利用CasDrop体系观察了BRD4在微卫星重复区、端粒和致密异染色质区的相变，发现BRD4在染色质低密度区域能够被诱导形成液滴，而在染色质高密度区，BRD4的液滴则仅在其周围形成液滴。计算模拟也得到了类似的结果——液滴在异染色质区域将形成花瓣样结构（下图）。当CasDrop体系将BRD4的液滴锚定在异染色质区域内HP1α密度相对较低的区域时，作者发现随着液滴的增大，HP1α被逐步剔除出该区域；而部分增大的BRD4液滴则可以扰乱异染色质的结构，最终使得该区域形成染色质密度下降。这些发现表明在相变发生的过程中，其周围的染色质提供了一定的机械阻力。

BRD4“液-液相分离”的液滴与HP1α富集的异染色质互不相溶，形成花瓣样结构

考虑到先前研究表明，超级增强子和其他核蛋白的相变能够将特定基因区域的距离拉近【5, 6】，作者对集中于端粒的“液-液相分离”液滴进行了进一步研究：端粒区的相变如花瓣样集中于异染色质的周围，液滴与异染色质间相互粘附；当两个液滴相互融合时，其各自所粘附的异染色质区域则靠拢在一起。

本文所证实的核内相变液滴排斥染色质的倾向有其物理学意义：“液-液相分离”液滴对染色质的排斥会导致染色质结构的重塑。这一过程则需要应变能——即染色质内部储存的机械能的释放——而这一过程从热力学角度来讲是不经济的。因此，染色质本身的性质会影响相变液滴的形成——即相变易发生在染色质结构较为疏松、应变能较低的区域；染色质致密区域的较小的相变液滴则最终倾向于溶解。“液-液相分离”的这一性质被总结为染色质过滤模型（“Chromatin Filter” model）（下图），即结合在特定基因位点的蛋白质的相变能够将距离较远的基因拉近，且排斥不含结合位点的背景基因区域。这保证了超级转录因子在染色质结构疏松的区域的聚积、对染色质的折叠、和促进活跃基因的表达（Science亮点丨超级增强子通过相分离调控基因表达）。

Chromatin Filter Model

参考文献

1.    Boeynaems, S., et al., Protein Phase Separation: A New Phase in Cell Biology.Trends Cell Biol, 2018. 28(6): p. 420-435.

2.    Shin, Y., et al., Spatiotemporal Control of Intracellular Phase Transitions Using Light-Activated optoDroplets.Cell, 2017. 168(1-2): p. 159-171.e14.

3.    Tanenbaum, M.E., et al., A protein-tagging system for signal amplification in gene expression and fluorescence imaging. Cell, 2014. 159(3): p. 635-46.

4.    Yuntao S. Mao, B.Z., David L. Spector, Biogenesis and function of nuclear bodies.Trends in Genetics, 2011. 27(8): p. 295-306.

5.    Sabari, B.R., et al., Coactivator condensation at super-enhancers links phase separation and gene control.Science, 2018. 361(6400).

6.    Boija, A., et al., Transcription Factors Activate Genes through the Phase-Separation Capacity of Their Activation Domains.Cell, 2018. 175(1-14).