Hairpin DNA修饰电极表面发卡构型的评测、调控及其传感性能的提升

注：文末有研究团队简介 及本文作者科研思路分析

Hairpin DNA（以下简称hpDNA）是一种能形成茎-环相连“发卡状”构型的单链DNA（ssDNA）。由于hpDNA能与多种目标物高选择性结合并引发显著的结构翻转，作为探针已广泛应用于分析检测领域，特别是在基片传感器和分子器件等领域表现出特别的优势。需要指出的是，这类器件的性能主要取决于hpDNA链在基片表面发卡构型的高效“应激”翻转，而在基片（电极、芯片等）表面高产率地形成发卡构型是保障其结构翻转的前提。棘手的是，hpDNA在溶液中常以混合构型（即单链卷曲构型、发卡构型、头-尾相连二聚体构型）的形式存在，因而组装到基片表面的通常也是具有混合构型的探针膜。更为遗憾的是，目前不仅缺乏促使hpDNA探针在基片表面高效形成发卡构型的有效组装工艺，还特别欠缺定量评价hpDNA探针在基片实际形成发夹构型产率的简便方法，更不用说对发夹构型进行原位调控。

最近，北京师范大学的李运超教授（点击查看介绍）课题组与加拿大Simon Fraser大学的于化忠教授（点击查看介绍）课题组合作，将Exo I（一种DNA特异性外切酶，可将ssDNA从3'端到5'端逐步水解成单核苷酸）对ssDNA选择性剪切的能力和Ru(NH₃)₆³⁺对DNA链电化学定量标记的能力相结合，实现了对电极表面hpDNA发卡状构型的定量评测与可控调控，并进一步设计出高灵敏的hpDNA基生物传感器。

他们首先借助凝胶电泳（gel）、电化学循环伏安（CV）技术以及电喷雾质谱（ESI-MS）技术，发现并建立了一种能有效区分电极表面固定的ssDNA和hpDNA的“Exo I水解辅助构型区分法”，即利用适中活性的Exo I能高效“剔除”ssDNA而“完好”保留hpDNA链的水解特性。他们还发现Exo I对ssDNA链的水解作用会受到基片位阻效应的显著影响，通常会留下12个碱基左右的残余片段（Anal. Chem., 2017, 89, 2464）。在此基础上，他们利用Ru(NH₃)₆³⁺探针的电化学标记与定量功能，通过定量比较电极表面在Exo I水解前（混合膜）和水解后（纯hpDNA膜）所固定DNA链数量（可用积分电量表示）的变化，实现了定量评测电极表面固定hpDNA链的数量以及比例这一“棘手”目标。利用这一方法，他们系统探究了组装溶液中DNA组成（即ssDNA/hpDNA比值）与电极表面组装膜中这两种DNA构型比例之间的关联性；揭示了链密度对发夹构型形成产率的显著影响。此外，他们还采用“短链DNA选择杂交策略”验证了Exo I水解辅助电化学构型评测这一方法的可靠性。

更重要的是，他们还发现Exo I在辅助构型定量的同时，还可有效消除由非发卡构型引起的背景信号，从而显著提高hpDNA基生物传感器的响应性能。以人类免疫缺陷病毒-1（即HIV-1）基因片段检测为例，经Exo I“修整”的hpDNA基电化学传感器可将检测限降低到未处理前的1/120。此外，从原理上讲，Exo I辅助的构型定量评测和背景消除策略还可适用于其他具有特殊构型的DNA体系（如G-四连体、i-motif、Y-shape等)，因此对构建高灵敏度生物传感器及DNA分子器件具有广泛而又重要的意义。

这一成果近期发表在Analytical Chemistry 上，文章的第一作者是北京师范大学的博士研究生高晓怡。该工作受到国家自然科学基金面上项目（No.21573024）的支持。

该论文作者为：Xiaoyi Gao, Xinglin Wang, Yunchao Li, Jiale He, and Hua-Zhong Yu

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面，或点此查看原文）：

Exonuclease I‑Hydrolysis Assisted Electrochemical Quantitation of Surface-Immobilized DNA Hairpins and Improved HIV‑1 Gene Detection

Anal. Chem., 2018, 90, 8147, DOI: 10.1021/acs.analchem.8b01445

通讯作者简介

李运超，北京师范大学化学学院教授、博士生导师；于2005年在中科院化学研究所获博士学位（研究方向为纳米材料化学），随后在加拿大SFU化学系开展了三年博士后研究（研究方向为生物分析化学）；于2008年9月进入北京师范大学工作；目前主要从事新型光电功能纳米材料的合成与器件化、新型光电生物传感器的构建与应用等方面的研究工作；迄今已在SCI核心期刊上发表研究论文50余篇（被引用逾2200余次，H index为22），曾荣获2005年度中科院保洁优秀博士生奖，入选2010年度北京市科技新星。

李运超

http://www.x-mol.com/university/faculty/49886

于化忠

http://www.x-mol.com/university/faculty/49887

科研思路分析

Q：这项研究最初是什么目的？或者说想法是怎么产生的？

A：如上所述，有鉴于hpDNA作为探针在基片传感器和分子器件领域具有重要的应用价值以及常因存在混合构型而制约其响应性能发挥的现状，我们意识到定量评测以及调控基片表面hpDNA发卡构型数量的重要性，此即为该研究的最初动机。为此，我们计划建立一种行之有效的定量评价基片表面hpDNA发卡构型数量的方法，实现hpDNA发卡构型可控调控以充分发挥其优异的检测与响应性能。

Q：研究过程中遇到哪些挑战？

A：发现并证实Exo I对电极表面不同构型DNA的水解行为的显著差异是该研究的核心技术基础与技术难点。

此外，如何在纳米尺度和单分子水平上精细地表征基片表面hpDNA在“应激反应”前后的构型的变化以及DNA链在酶剪切前后结构的改变是目前遇到的最大挑战；未来希望与相关领域的研究者一起合作将此研究推向更精细、更深入的层次。

Q：该研究成果可能有哪些重要的应用？

A：预期该项目发展的Exo I 辅助hpDNA发卡构型定量评测和背景消除策略可显著提升hpDNA基生物传感器及分子器件的响应和检测性能。当然，该技术也将有助于其它特殊构型（如G-四连体、i-motif、Y-shape等）DNA传感和开关器件性能的改善。