邵峰组发现细菌中新的模式识别受体——蒋争凡、李继喜解读点评

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最近一段时间，有部分人开始觉得天然免疫领域已经没有多少“肉”可以吃了，甚至觉得“骨头”也不多了，但是如果有新的病原相关分子模式及其相应的模式识别受体被鉴定出来，那又是另一番风景了。今日，邵峰研究组最新发表在Nature上的成果正是全面展示了一条新的模式识别通路，可以称得上是开辟了新的免疫学研究领域。Nature同期还配发了评论文章，高度评价了该工作。为了将邵老师组的这项重要工作更清晰的呈献给读者，BioArt特别邀请到了长期从事天然免疫相关研究的专家、北京大学生命科学学院蒋争凡教授以及复旦大学生命科学学院李继喜教授进行了深度解析与点评，以飨读者！

在哺乳动物中，宿主细胞通过模式识别受体（Pattern Recognition ReceptorPRR）精确辨别病原体相关分子模式（Pathogen Associated Molecular PatternsPAMPs），启动天然免疫反应并指导适应性免疫应答，从而抵抗病原微生物的入侵(Medzhitov, 2007, 2009)。

模式识别理论是现代免疫学的基石之一，寻找和鉴定新的病原相关分子模式及其相应的模式识别受体是当代免疫学研究中“皇冠上的明珠”。历史上每发现一条新的模式识别通路，都无一例外地开辟了新的免疫学研究领域，其引发的研究热潮也会促进人类对免疫系统与病原微生物互作机制的认知。对于细菌而言，最为著名的例子便是：模式识别受体TLR4通过识别革兰氏阴性菌的细胞壁脂多糖LPS分子，进而实现对一大类革兰氏阴性菌的广谱泛特异性识别和免疫应答。

随着研究的深入，人们逐渐发现革兰氏阴性菌中除了LPS以外，在LPS生物合成过程中必不可少的庚糖代谢物同样可以激活天然免疫应答。多伦多大学Gray-Owen研究组2015年报道了两种病原菌 Neisseria meningitidis 和 Neisseria gonorrhoeae 能够释放一种热稳定的分子1,7二磷酸庚糖(Heptose 1,7-bisphosphate，以下简称“HBP”)造成TIFA(TRAF-interacting protein with forkhead-associated domain)-TRAF6(tumor necrosis factor receptor–associated factor 6)依赖的NF-κB的活化(Gaudet et al., 2015)。HBP是LPS合成过程中的中间代谢产物，广泛存在于革兰氏阴性菌中，但是HBP是否作为真正的PAMP及其对应的识别受体还未明确。

8月16日，Nature在线发表了北京生命科学研究所邵峰研究组题为Alpha-kinase 1 is a cytosolic innate immune receptor for bacterial ADP-heptose 的研究论文，首次发现并证明细菌中ADP-Hep进入宿主细胞后结合激酶ALPK1 N-端结构域，并刺激C-端激酶结构域磷酸化活化TIFA，介导III型分泌系统(type III secretion system, T3SS)依赖的NF-κB的活化和细胞因子的产生。系统证明了存在于所有革兰氏阴性菌和部分革兰氏阳性菌中的代谢产物ADP-Hep作为真正的PAMP，能够透过哺乳动物的细胞膜，被作为PRR的广泛表达的ALPK1激酶识别，诱导细胞因子的产生。

该研究首先使用转座子筛选法鉴定出了激活天然免疫缺陷的菌株，从而找出了具体的作为病原相关分子模式的庚糖代谢物是ADP-heptose（ADP-β-D-manno-heptose）而非HBP。通过CRISPR–Cas9高通量筛选的方法，研究组进一步找出了无法识别ADP-heptose刺激的基因缺陷细胞，从而确定了识别ADP-heptose的模式识别受体是ALPK1。最后，通过生物化学、结构生物学和遗传学等多种方法，从分子机制、基因缺陷细胞和小鼠等多个水平，证明了免疫系统通过ALPK1识别革兰氏阴性菌的ADP-heptose，从而实现模式识别并下游免疫信号转导的分子机制。该研究同时鉴定出了新的病原相关分子模式和与其对应的模式识别受体，描绘出了一条完整的信号转导通路，具有非凡的原创性和实际应用价值。

研究者首先从21000株 Y. pseudotuberculosis 突变体中筛选到37种基因突变无法诱导NF-κB驱动的荧光素酶的表达，排除涉及T3SS分泌系统（III型分泌系统）的大多数基因后，最终锁定候选基因hldE。此外，研究者发现gmhA缺陷同样不能激活NF-κB，而gmhB或hldD缺陷与野生型相比没有差异，这似乎说明Y. pseudotuberculosis激活NF-κB似乎也依赖于HBP，印证了之前在Neisseria meningitidis中的发现。然而和ΔhldE和ΔgmhA缺陷株不同，ΔgmhB突变株中由于未知的gmhB冗余蛋白的作用，ADP-Hep的代谢仍在发生，并进一步通过电转的方法，发现除了S7P（D-sedoheptulose 7-phosphate）以外，合成的HBP和ADP-DD-Hep或者ADP-LD-Hep都能够刺激NF-κB的活化，如直接向细胞添加这些庚糖衍生分子，只有ADP-heptose仍然显示出激活NF-kB活性，说明ADP-heptose具有自主进入细胞质的功能。因此，认为ADP-Hep是一个潜在的通用的PAMP。

为了寻找ADP-Hep的受体及下游分子，研究者利用ADP-Hep激活NF-κB这一特性，进行了基于CRISPR-Cas9的筛选，并最终找到了ALPK1(Milivojevic et al., 2017; Zimmermann et al., 2017),TIFA和TRAF6。他们发现ALPK1或TIFA的缺失能够阻断ADP-LD-Hep（电转或胞外添加）诱导的NF-κB的活化和IL-8的产生，并分别依赖于ALPK1的激酶活性及TIFA T9位的磷酸化修饰。此外，TIFA T9位的磷酸化及eGFP-TIFA聚点的形成也依赖于ALPK1激酶活性。这些结果表明ADP-Hep通过ALPK1-TIFA-TRAF6级联反应激活NF-κB。

(a) ADP-Hep在革兰氏阴性菌中的合成途径；(b) HldE腺苷转移酶分别催化H1P和HBP合成ADP-Hep及ADP-heptose7-P；(c) ADP-Hep激活ALPK1激酶结构域依赖的NF-κB的活化；(d) ADP-Hep结合ALPK1-NTD的结构示意图及ALPK1对应位点突变后不能发生ADP-Hep诱导的NF-κB的活化。

ALPK1包含一个α螺旋结构域（NTD，1-492）以及一个激酶结构域（KD），两个结构域之间由一段链接区域组成（下图）。

研究者还发现同时表达ALPK1-N492（1-492）及ALPK1-ΔN492（缺乏1-492），可支持ADP-LD-Hep或Y. pseudotuberculosis诱导的NF-κB的活化及TIFA的磷酸化。值得注意的是，从野生型E. coli而不是E. coli ΔhldE纯化的ALPK1-NTD和ALPK1-KD (ALPK1-(N+K)) 能够在体外直接造成TIFA T9位的磷酸化，相比之下，ALPK1-(N+K)在哺乳动物细胞中的活化则需要Y. pseudotuberculosis感染或ADP-LD-Hep的刺激。

通过测定ALPK1-NTD的晶体结构，他们发现，该结构域直接结合了一个ADP-Hep分子，ADP-Hep的两个磷酸基团通过氢键被R116, R150, R153及K233固定在ALPK1-NTD凹面的狭窄口袋，ADP腺苷与F295互作并与S236及T237形成两个氢键，庚糖C3和C4氢氧根被Q67和D231固定，C2和C6被K233固定，C7被R153固定，庚糖骨架与F61互作。重要的是，上述ADP-Hep与ALPK1的互作位点在脊椎动物中都是相对保守的，相应位点突变后的ALPK1也失去了ADP-LD-Hep诱导下NF-κB的活化。Apo-ALPK1-(N+K)不能直接磷酸化TIFA，必须结合ADP-LD或DD-Hep，证明了ALPK1是ADP-Hep的受体。

相比之下，HBP与Apo-ALPK1-(N+K)的亲和力很低，并且ALPK1-(N+K)与HBP共孵育后既不能识别底物也不能催化ATP水解。结合化学交联和质谱实验发现，相对于HBP，ADP-LD-Hep与ALPK1-NTD的结合会造成更大的构象改变从而暴露更多的催化活性区域。此外，HBP可以被腺苷转移酶HldE催化转化为ADP-heptose 7-P, 而后者能够直接激活ALPK1及NF-κB，这也解释了HBP转染下NF-κB的活化。ALPK1(Q67A), ALPK1(Y68A)（双）突变失去了对HBP或ADP-heptose 7-P的反应，但是仍被Y. pseudotuberculosis或ADP-Hep激活，说明Y. pseudotuberculosis的确通过ADP-Hep激活宿主免疫反应。

最后，小鼠体内实验证明ADP-LD-Hep能够招募大量中性粒细胞并上调NF-κB介导的趋化因子和细胞因子的产生。感染B. cenocepacia的Alpk1^−/−小鼠，相对于野生型小鼠表现出更低的细胞因子的产生及更高的细菌繁殖数量，从而在小鼠体内水平阐明了ADP-Hep-ALPK1-TIFA信号通路的生理学意义。

本文首次系统证明了存在于所有革兰氏阴性菌和部分革兰氏阳性菌中的代谢产物ADP-Hep作为PAMP，能够透过哺乳动物的细胞膜，被作为PRR的广泛表达的ALPK1激酶识别，诱导细胞因子的产生，因此，ADP-Hep具有被用作免疫调节剂和疫苗佐剂的巨大应用潜力。

这项研究揭示了除TLR4(Poltorak et al., 1998)和caspase-11(Shi et al., 2014)之外的第三条针对脂多糖LPS的模式识别通路，ALPK1识别的不是LPS本身而是LPS合成过程中的核心庚糖代谢物。这些发现将指引我们探索其它PAMP-PRR的作用本质，并帮助我们了解细菌性致病菌的入侵机制，为相关疾病的药物研发提供靶点。

更加令人眼前一亮的是，该研究证明了免疫细胞甚至可以利用自身的生物合成系统，“代替”细菌完成产生ADP-heptose的某些步骤，从而使得ADP-heptose的一些上游代谢物都获得了激活ALPK1通路的能力，从而扩招了免疫系统所能够识别的庚糖代谢物的种类，其中所展现出的免疫系统的“智慧”妙不可言。另外一点值得注意的是在发现ALPK1中所使用的CRISPR–Cas9高通量筛选法，邵峰教授研究组也曾经利用相似的技术路线筛选出了细胞焦亡通路中的关键效应分子GSDMD，说明了CRISPR–Cas9筛选在新通路、新基因发现和鉴定中强大的功能。

参考文献

1. Gaudet, R.G., Sintsova, A., Buckwalter, C.M., Leung, N., Cochrane, A., Li, J., Cox, A.D., Moffat, J., and Gray-Owen, S.D. (2015). INNATE IMMUNITY. Cytosolic detection of the bacterial metabolite HBP activates TIFA-dependent innate immunity.Science348, 1251-1255.

2. Medzhitov, R. (2007). Recognition of microorganisms and activation of the immune response.Nature449, 819-826.

3. Medzhitov, R. (2009). Damage control in host-pathogen interactions.Proc Natl Acad Sci U S A106, 15525-15526.

4. Milivojevic, M., Dangeard, A.S., Kasper, C.A., Tschon, T., Emmenlauer, M., Pique, C., Schnupf, P., Guignot, J., and Arrieumerlou, C. (2017). ALPK1 controls TIFA/TRAF6-dependent innate immunity against heptose-1,7-bisphosphate of gram-negative bacteria.PLoS Pathog13, e1006224.

5. Poltorak, A., He, X., Smirnova, I., Liu, M.Y., Van Huffel, C., Du, X., Birdwell, D., Alejos, E., Silva, M., Galanos, C., et al. (1998). Defective LPS signaling in C3H/HeJ and C57BL/10ScCr mice: mutations in Tlr4 gene.Science282, 2085-2088.

6. Shi, J., Zhao, Y., Wang, Y., Gao, W., Ding, J., Li, P., Hu, L., and Shao, F. (2014). Inflammatory caspases are innate immune receptors for intracellular LPS.Nature514, 187-192.

7. Zimmermann, S., Pfannkuch, L., Al-Zeer, M.A., Bartfeld, S., Koch, M., Liu, J., Rechner, C., Soerensen, M., Sokolova, O., Zamyatina, A., et al. (2017). ALPK1- and TIFA-Dependent Innate Immune Response Triggered by the Helicobacter pylori Type IV Secretion System.Cell Rep20, 2384-2395.

李继喜（复旦大学生命科学学院教授）

生物体在病原微生物(病毒、细菌等)感染后，通过细胞膜表面或者胞质内的模式识别受体（PRRs）识别病原相关分子模式（PAMPs）和危险信号相关分子模式（DAMPs），从来激活一系列的信号转导通路，诱导炎症因子和I型干扰素的表达。目前已知天然免疫系统的模式识别受体主要包括TLRs（Toll like receptors）、RLRs（RIG-I like receptors）、ALRs（AIM2 like receptors）、NLRs（NOD like receptors）和cGAS/STING这5类。它们识别不同的分子，如病毒RNA/DNA、细菌脂多糖（LPS）、细菌CDNs、真菌肽聚糖（PGN）等，引起一些共同的细胞信号命运，如NF-kB激活、I型干扰素产生、细胞因子成熟及细胞死亡等。但病原微生物多种多样，是否还存在新的识别PAMPs的模式识别受体，其结构特点和功能机制如何，一直是天然免疫应答领域中很有意思的科学问题。

革兰氏阴性菌如大肠杆菌、沙门氏菌、耶尔森氏菌等通过III型分泌系统（T3SS）来激活NF-κB，表达不同的细胞因子。但2009年Isberg组发表在PloS Pathogen的研究显示【1】，把假结核耶尔森氏菌（Y.pseudotuberculosis）所有6个T3SS都敲除，仍然可以激活NF-κB信号，这表明宿主细胞质里存在可以识别细菌代谢物的新型受体。2015到2017年3个研究组【2,3,4】先后通过基因组RNA干扰（RNAi）的方法，在幽门螺旋杆菌IV型分泌系统和志贺氏菌中发现细菌代谢中间物HBP可以激活宿主细胞NF-κB信号，其中ALPK1和TIFA蛋白对于TRAF6寡聚化和信号激活十分重要。但HBP是否可作为PAMP，细胞内的相应PRR是什么并不清楚。在本期Nature杂志，北京生命科学研究所邵峰院士课题组发现ALPK1是细菌ADP-heptose的胞质受体。这是他们在鉴定出细菌flagellin和TTSS rod 蛋白受体NAIPs【5】、LPS受体Caspase11后取得的又一重大突破。

通过大规模的转座子突变体分析，邵峰课题组在luciferase和eGFP报告系统中筛选到37个缺失突变。进一步通过质谱和生化方法，发现ADP-heptose是一个新的PAMP；利用大规模的CRISPR-Cas9方法筛选出ALPK1、TIFA及TRAF6是激活NF-κB所必需。基因敲除/回补及突变体酶活实验表明蛋白激酶ALPK1是ADP-heptose的胞质受体。由于ALPK1的相关研究很少，他们又通过蛋白质晶体学方法获得了ALPK1-NTD-ADP-Hep复合物的高分辨率三维结构；进一步在细胞和小鼠模型上研究了ALPK1作为胞质受体的生理功能。

总之，与2015年发现细胞焦亡执行者GSDMD蛋白一样【7】，该研究充分利用基因组范围的缺失体筛选技术、质谱及晶体学方法以及小鼠实验，从全方位、多角度筛选出细菌激活NF-κB的新型胞质受体，这对于将来发现和鉴定其他病原微生物的PAMPs和PRRs也提供了很好的借鉴和促进作用。

编者后记：有很多新的发现在一开始可能觉得是正确的，但是如果有些核心问题没有解决，那么相关领域就容易“着急穿跑偏了”。另一点值得注意的是，早在2012年就有一篇发表在JEM上的文章声称找了一个基因位点对肝螺杆菌诱导的肠炎和癌症至关重要【8】，这个locus里四个基因中正好有本文筛选出的关键基因Alpk1和Tifa，或许多年以前研究人员并不能解释为什么是这些基因与肠炎和癌症有关，但是相信他们如果读了邵峰老师课题组的这篇文章，也许会豁然开朗。

参考文献：

1.  Auerbuch V et al. (2009) Innateimmune recognition of Yersinia pseudotuberculosis type III secretion.Plos Pathog.5(12):e1000686.

2. Gaudet RG et al. (2015) Cytosolicdetection of the bacterial metabolite HBP activates TIFA-dependent innateimmunity.Science348(6240):1251-5.

3. Milivojevic M et al. (2017) ALPK1controls TIFA/TRAF6-dependent innate immunity against heptose-1,7-bisphosphateof gram-negative bacteria.Plos Pathog. 3(2):e1006224.

4. Zimmermann S et al. (2017) ALPK1-and TIFA-Dependent Innate Immune Response Triggered by the Helicobacter pyloriType IV Secretion System.Cell Rep.20(10):2384-2395.

5. Zhao Y et al. (2011) The NLRC4inflammasome receptors for bacterial flagellin and type III secretionapparatus.Nature477, 596–600.

6. Shi J et al. (2014) Inflammatorycaspases are innate immune receptors for intracellular LPS,Nature514,187-192.

7. Shi J et al. (2015) Cleavage of GSDMD by inflammatorycaspases determines pyroptotic cell death,Nature526, 660–665.

8. Boulard, O., Kirchberger, S., Royston, D. J., Maloy, K. J., & Powrie, F. M. (2012). Identification of a genetic locus controlling bacteria-driven colitis and associated cancer through effects on innate inflammation.Journal of Experimental Medicine, 209(7), 1309-1324.