大家好！这次给大家分享的文献是2022年6月10日发表在Biomaterials杂志上的文章，标题为“Silk sericin patches delivering miRNA-29-enriched extracellular vesicles-decorated myoblasts (SPEED) enhances regeneration and functional repair after severe skeletal muscle injury”文章主要验证富含 miRNA-29 的外泌体修饰成肌细胞的丝胶蛋白贴片（SPEED）是否可以促进严重骨骼肌损伤后的再生和功能修复。作者来自华中科技大学同济医学院附属协和医院组织工程与再生医学研究中心、胃肠外科以及检验科，通讯作者是华中科技大学同济医学院附属协和医院组织工程与再生医学研究中心以及检验科的王琳教授，王琳教授的主要研究方向是组织工程和再生医学领域，特别关注生物材料在组织修复中的应用。
【背景介绍】
肌源性细胞疗法是一种潜在有效的严重骨骼肌损伤的治疗手段，并且促进瘢痕组织减少的肌纤维快速再生的治疗策略是骨骼肌再生的关键，只有适当的肌成纤维细胞活动对于组织修复是必要的，但过度或持续的肌成纤维细胞活动可能导致纤维化，影响肌肉的正常功能和再生能力。有相关研究显示，microRNA-29 (miR29)：不仅是肌生成的正调节因子，而且能够抑制C2C12成肌细胞向肌成纤维细胞的转分化。而促纤维化因子之一的TGF-β1抑制成肌细胞的融合和肌管形成，还抑制成肌细胞中miR29的表达。此外，通过之前的研究表明细胞外囊泡（ev）在原代细胞中具有快速的miRNA传递作用。并且细胞外囊泡（ev）处理的受体细胞未检测到明显的毒性和炎症反应。丝胶蛋白具有较低的免疫原性、天然的细胞粘附性、生物可降解性和多种生物活性，同时丝胶蛋白支架在体内的降解时间约为8～12周。基于上述材料，本研究设计了一种基于丝素蛋白（sericin）的生物材料，能够作为支架支持细胞生长，同时利用富含miR29的细胞外囊泡（EVs）修饰肌母细胞。这种新颖的组合策略（命名为SPEED）不仅提高了肌母细胞的成肌能力，还抑制了纤维化相关基因的表达，从而促进了骨骼肌的再生与功能恢复。
【研究思路】
作者首先对细胞外囊泡（EVs）进行纯化，接着是表征分析。使用超速离心法从过表达miR29的HEK293T细胞培养上清中纯化EVs。通过透射电子显微镜（TEM）观察EVs形态，并通过动态光散射（DLS）测定EVs的尺寸分布，使用Western blot验证EVs的特征性蛋白表达以及验证miR29被包裹在囊泡中，最后验证了miR29 - EVs是否可以被成肌细胞摄取并且发挥相应的作用。其次是丝素蛋白贴片的制备与表征首先采用从桑蚕丝中分离的丝素蛋白，使用京尼平（genipin）作为交联剂形成水凝胶，并通过冷冻干燥制成贴片。通过扫描电子显微镜（SEM）分析贴片的微观结构，评估其孔隙率和孔径。使用动态溶胀实验测试贴片在不同pH值下的溶胀特性。通过MTS实验评估贴片上细胞的附着和增殖能力。接着是作者对骨骼肌损伤模型的制备、损伤修复的治疗以及治疗评估。首先在小鼠胫骨前肌（TA）注射心脏毒素（CTX）诱导严重骨骼肌损伤。分别对实验组进行以下治疗：（1）PBS对照组；（2）含有miR29-EVs的成肌细胞；（3）负载Ctrl-EVs的丝素贴片（SS/Ctrl-Cells组）；（4）负载miR29-EVs的丝素贴片（SPEED），在治疗后第二周和第四周时通过HE染色和Masson三色染色检测肌肉再生和纤维化程度。使用肌肉收缩力测试（包括快缩力量和强直力量）评估TA肌肉的功能恢复。使用加速旋转杆实验评估小鼠运动能力。最后进行RNA-seq分析，为了分析在治疗后对TA肌肉进行转录组测序，分析差异表达基因，并进行基因本体（GO）和KEGG通路富集分析。还通过蛋白-蛋白互作网络分析探索可能的分子机制。
【制备流程】
（1）准备miR29-enriched extracellular vesicles (miR29-EVs):
利用转染技术将含有miR29的表达载体（如pMIR-miR29）转染到HEK293T细胞中。在转染后，将细胞培养在无血清的DMEM培养基中，收集培养上清。通过超速离心等方法从培养上清中分离出miR29-EVs，并进行蛋白含量测定和Western blot检测以确认EVs的纯度和蛋白表达。
（2）制备丝素蛋白贴片（silk sericin patch）:
从蚕茧中提取丝素蛋白。使用genipin作为交联剂，将丝素蛋白制成水凝胶。将水凝胶冷冻干燥后形成丝素蛋白贴片，并进行消毒处理。
（3）肌细胞（myoblasts）的培养和修饰:
从新生小鼠中分离出原始肌细胞，并在体外培养。将分离的miR29-EVs与肌细胞共孵化，使肌细胞吸收EVs，从而将miR29传递到肌细胞中。
（4）将修饰后的肌细胞种植到丝素蛋白贴片上:
将吸收了miR29-EVs的肌细胞种植到预先准备好的丝素蛋白贴片上。
【数据分析】
采用超速离心法从过表达miR29的HEK293T细胞培养上清中分离纯化miR29 - EVs。如图1A 所示在干燥状态下，透射电子显微镜显示miR29 - EVs为直径50 ~ 80 nm的双层囊泡。图1B 是在水化状态下，动态光散射(峰值尺寸为188 nm)测定的miR29 - EVs的大小比透射电子显微镜测定的大得多。采用WB分析EVs和HEK293T细胞中蛋白的表达情况。图1C )细胞外囊泡富集蛋白，包括四跨膜蛋白家族成员( CD9、CD63和CD81)在miR29 - EVs和Ctrl - EVs中被检测到，而细胞内蛋白( GOLGA2和CANX)仅在HEK293T细胞中被检测到。作者为了确定miR29 - EVs是否可以被成肌细胞摄取。首先使用膜染料PKH26，如图1D 所示，发现孵育后miR29 - EVs阳性的成肌细胞数量逐渐增加。图1E 表明在处理后4 h，超过65 %的成肌细胞PKH26荧光呈阳性。为了进一步研究miR29 - EVs对成肌细胞分化的影响，作者在成肌细胞分化过程中进行了免疫荧光染色。图1F和G显示发现TGF-β1降低了肌球蛋白重链(MyHC)阳性肌管的数量。但miR29EVs预处理显著增加了原代成肌细胞的数量。图1H表明Western blot进一步证实，miR29 - EVs处理后，miR29靶基因（COL1A1、YY1、LIMS1)的表达被显著抑制。图1I中显示由于YY1可以抑制肌生成，结果发现成肌基因Myo D、Myh4、Myo G、Acta 1和Tnnt1的mRNA水平随着Yy1的降低而上调。由于促纤维化作用也被抑制,图1J可以看到纤维化基因(Lims1，Col1a1，Col1a2，Col3a1，α- SMA和Vim)的mRNA水平下调。
图 1 miR29 – Evs的表征及其对成肌细胞的影响
为了制备成肌细胞接种用丝胶贴片，将京尼平作为交联剂，与丝胶按比例交联形成丝胶水凝胶。经过后续的冷冻和冻干步骤后，丝胶蛋白支架被制备出来，并且可以在形状和尺寸不变的情况下重新水化(图2A)。图2B为丝胶贴片植入小鼠体内的大小。丝胶贴片正面断面的扫描电子显微镜的显微照片。发现贴片具有较高的孔隙率，平均孔径为173 μ m，孔隙率高达93 %。这有利于营养物质的扩散和成肌细胞的迁移，从而有利于骨骼肌的有效再生(图2C)。图2D为在正常生理条件(pH7.4)和损伤条件(pH 5.5 )下评价丝胶贴片的溶胀率。结果表明，浸泡后第1天，溶胀曲线急剧上升，随后变得平滑(图2D )，这将有利于防止丝胶贴片植入体内后持续的溶胀导致的挤压损伤。为了验证丝胶贴片能否支持成肌细胞的黏附和生长，将C2C12成肌细胞接种到贴片上，通过罗丹明-鬼笔环肽染色C2C12细胞，观察在丝胶贴片上的纤维状肌动蛋白（F-actin，红色）。发现接种后第7天，贴附的成肌细胞铺展在贴片上，应力纤维（黄色箭头）取向良好(图2E )。MTS检测显示，随着培养时间的延长，成肌细胞的细胞活力逐渐增加，表明成肌细胞能够在丝胶贴片上增殖8天以上(图2F )。为了评价丝胶贴片在体内的降解情况，将再水合后的贴片沿胫骨前肌（TA）皮下埋植。贴片在植入后第4周被大量降解，到第6周几乎完全降解，表明丝胶贴片具有合适的降解速率，因此不需要在植入后进行第二次手术去除(图2G )。
图 2 丝胶贴片的表征
为了评估移植物在体内对外源性成肌细胞整合的影响，在小鼠严重肌肉损伤模型中，将GFP阳性的原代成肌细胞与丝胶贴片一起植入。在CTX注射后第5天将移植物植入小鼠体内，免疫荧光染色显示，在接受丝胶贴片治疗的TA肌肉中观察到GFP / MyHC双阳性肌纤维，而在仅成肌细胞移植组(数据未显示)中，在治疗后1周观察不到GFP / MyHC双阳性肌纤维(图3A )。图3B 表明与丝胶贴片递送Ctrl-EVs修饰的成肌细胞(SS/Ctrl-Cells组)相比，更多的miR29-EVs修饰的成肌细胞被整合到宿主肌纤维中(SPEED组)。为了确定miR29-EVs是否影响成肌细胞和驻留肌纤维的整合，作者系统分析了miR29 - EVs对成肌细胞行为的影响，包括凋亡、迁移和增殖。在凋亡激活剂H2O2存在的情况下，miR29-EVs处理不影响成肌细胞凋亡率(图3C和D)。划痕实验显示，Ctrl - EVs修饰的成肌细胞和miR29 - EVs修饰的成肌细胞的移动距离相同(图3E和F)。细胞生长曲线显示细胞增殖也无明显差异(图3G)。
图 3 成肌细胞整合到宿主TA肌肉中
为了检测SPEED在体内的治疗效果，作者评估了严重骨骼肌损伤小鼠模型中肌纤维的再生情况。将TA肌肉严重损伤的小鼠被随机分配到4个组( 1 ) PBS ( PBS组)，( 2 ) miR29 - EVs修饰的成肌细胞( 29 -细胞组)，( 3 )丝胶贴片接种Ctrl - EVs修饰的成肌细胞( SS / Ctrl - Cells组)，( 4 )丝胶贴片接种miR29 - EVs修饰的成肌细胞( SPEED组)。在损伤后第4周进行H & E染色分析评价再生肌纤维。在损伤后的第4周，SPEED植入小鼠的纤维大小分布与正常小鼠( Sham组)相似(图4B)。考虑到miR29抑制成肌细胞向肌成纤维细胞的转变，作者评估了胫骨前肌的间质纤维化程度。Masson's三酸染色测定肌肉损伤修复引起的胶原沉积程度(图4C)。与除了Sham组的其他组相比，损伤的第4周，SPEED组TA肌纤维化程度明显较低，(图4D )，这表明可以有效地抑制了TA肌肉的纤维化。为了确定损伤TA肌肉的功能恢复情况，对肌肉收缩力和小鼠运动行为进行了评估。通过刺激坐骨神经并通过力传感器记录肌肉收缩来进行快肌力和强直肌力的定量测量，评估结果显示伤后4周，SPEED组大鼠的快收缩强度(图4E )和强直收缩强度(图4F )均恢复至正常水平( Sham组)。与Sham组小鼠相比，PBS组、29 - Cells组和SS/Ctrl-Cells组小鼠在CTX注射后第2周和第4周表现出明显的行为学障碍。然而，与PBS组相比，SPEED组小鼠表现出优异的转棒性能，并在损伤后第4周恢复正常运动能力(图4G )。
图 4 TA肌肉的结构和功能评估
为了进一步研究这种治疗策略的机制，作者对这5组小鼠在CTX注射后第2周的TA肌肉进行了全面的转录组分析。图5A的热图所示，只有SPEED组的TA肌显示出与sham组相似的基因表达模式，表明SPEED治疗可以快速有效地逆转严重骨骼肌损伤后的异常基因表达谱。而29 - Cells组与PBS组具有相似的基因表达模式，提示丝胶贴片这一递送载体可能在肌肉修复过程中发挥重要作用。与PBS组相比，植入SPEED组鉴定出1506个差异表达基因( DEGs )，包括与骨骼肌分化、发育和功能相关的基因( Stab2、Capn6、Tnni1、Smtnl2和Asb15)、代谢相关基因( Nr4a1、Klf15、Hk2和Ces1d)、促炎基因( Cxcl2和Cxcl5)和衰老相关基因( Cdkn2a ) (图5B )。图5C说明SPEED植入上调的基因主要涉及离子转运和代谢过程。KEGG通路分析表明，SPEED治疗导致许多代谢相关通路、肌肉发育和功能相关通路上调，如胰岛素信号通路、AMPK信号通路、钙信号通路(图5D ,左图)。与GO富集分析结果一致，SPEED治疗下调了与细胞-细胞和细胞-基质通信、细胞周期和炎症反应相关的通路(图5D ,右图)。基因集富集分析( GSEA )发现，KEGG TCA循环和KEGG氧化磷酸化的基因特征与SPEED植入显著相关，表明损伤TA肌肉的能量代谢得到明显改善(图5E )。为了鉴定SPEED处理后共有的转录调控因子，作者进行了转录因子富集分析。基因集富集分析( GSEA )显示SPEED治疗后与MEF2转录因子家族相关的基因表达变化最为显著(图5F)。总的来说，研究结果表明SPEED植入可以激活MEF2，改善能量代谢和肌肉微环境，从而导致满意的TA肌肉修复。
图 5 TA肌肉的RNA - seq分析
根据先前的研究表明CDC20在有丝分裂的成肌细胞中介导MEF2C的降解，作者推测SPEED植入可能通过抑制CDC20的表达来保护MEF2C不被降解，从而导致肌生成。首先评估了TA肌肉中CDC20和MEF2C的表达水平。免疫荧光染色结果显示，SPEED植入后，再生肌纤维中CDC20的荧光强度降低，MEF2C阳性的集中细胞核数量增加(图6A—C)。作者建立了Cdc20稳定敲低的C2C12细胞系，发现Cdc20的敲低增加了MEF2C的蛋白水平(图6D )。Cdc20的敲低增加了MEF2C下游成肌基因的mRNA水平，包括Myf6，Myom1，Myh1，MyoG，MyoD和Myh4(图6E ) 。这些结果表明SPEED植入通过下调CDC20 - MEF2C信号轴促进TA肌肉再生和修复(图6F )。
图 6 CDC20 - MEF2C信号轴调控肌肉再生。
SPEED改善TA肌肉的肌肉微环境：SPEED植入后，通过下调CDC20表达，促进肌纤维再生，抑制纤维化，从而改善TA肌肉的肌肉微环境。SPEED植入对受损TA肌肉基因表达模式的影响：SPEED治疗能够迅速有效地逆转严重骨骼肌损伤后的异常基因表达模式。CDC20-MEF2C信号轴参与SPEED植入后受损TA肌肉的再生：SPEED植入可能通过抑制CDC20表达来保护MEF2C免于降解，从而促进肌生成。SPEED作为一种有效的治疗策略：SPEED作为一种潜在的治疗策略，对于严重骨骼肌损伤的快速修复显示出优越的疗效，并且具有成本低、易于临床转化的优势。
该文章没有验证应用到HEK293T转染miR-29产生的miR29 – Evs和用于治疗严重骨骼肌损伤成肌细胞是否会产生免疫原性。
汇报人：乔林美