大家好！为大家介绍一篇2021年4月发表在Gastroenterology题为“Single Cell Transcriptional Survey of Ileal-Anal Pouch Immune Cells from Ulcerative Colitis Patients”的文章，影响因子为25.7分。文章从溃疡性结肠炎（UC）患者的J型储袋和结肠采集的活检样本中的免疫细胞及其活化状态进行了分析，发现储袋炎和溃疡性结肠炎期间的肠道炎症特征具有相似性，这可能对储袋炎的临床管理具有重要意义。单细胞RNA测序（scRNA-seq）可以实现对多项研究的元分析，这有助于识别用于炎症性肠病（IBD）患者个性化治疗的生物标志物。
【背景介绍】
回肠储袋肛管吻合术（IPAA）是目前治疗药物治疗无效的UC患者和预防性治疗家族性腺瘤性息肉病FAP的常用外科手段，通过切除病变的结肠和直肠，同时重建回肠储袋以恢复肠道功能。IPAA的核心在于“P（储袋）”的构建，即通过末端回肠折叠形成特定的囊袋结构（储袋），再与肛管吻合，从而最大程度地替代结直肠的生理功能。储袋的形状主要包括J型、W型和S型，其中J型储袋因其制作简单、功能优良而被最广泛采用，仅在少数系膜长度不足的患者中会选择W型或S型储袋。尽管J型储袋的构建是IPAA手术的标准，但有近50%的患者术后会发生储袋炎（Pouchitis），一种与IBD类似的肠道炎症，表现为腹泻、腹痛和直肠出血，目前缺乏特异性疗法，主要长期依赖抗生素治疗，疾病复发率高。目前储袋炎的病因不明，也尚不清楚储袋炎与UC炎症组织的免疫浸润是否相似。
【实验结果】
1 UC患者和J型储袋的结肠活检样本的免疫细胞转录景观
作者从接受IPAA手术治疗的患者和UC患者中收集了26份冷冻保存的肠道活检样本，分为三组：11名炎症性UC患者、10名储袋炎患者以及5名无炎症储袋患者，使用10X Genomics平台对CD45 +进行单细胞RNA测序。在所分析的细胞中，超过一半的细胞（30,863个）属于T细胞亚群，21,324个细胞属于B细胞亚群，剩余的3,747个细胞属于髓系细胞亚群（图1A）。具体来说，通过标记基因，鉴定得到T细胞、生发中心/滤泡细胞、浆细胞、循环B细胞、肥大细胞、单核细胞/巨噬细胞。主成分分析PCA显示，这6种主要免疫细胞群的相对比例并未显著区分炎症样本与非炎症样本，也未显著区分储袋样本与UC结肠样本。这表明在UC结肠和储袋样本中，主要免疫细胞群的组成特征没有显著差异。然而，在个体间的6种主要细胞群体的比例变化中，通过Wilcox检验发现，与无炎症储袋样本相比，储袋炎和炎症性UC患者样本中单核细胞/巨噬细胞的比例显著增加（图1C）。这表明炎症状态主要由髓系细胞（单核细胞/巨噬细胞）的差异驱动。
图1. 来自UC患者的储袋和结肠活检的免疫细胞景观
2炎症患者样本中单核细胞/巨噬细胞的比例增加
针对髓系细胞群进行聚类分析，得到6种髓系细胞亚群，包括3种不同类型的单核细胞/巨噬细胞亚群、肥大细胞、树突状细胞（DCs）以及少量浆细胞样树突状细胞（pDCs）（图2A）。通过差异分析(DE)确定每个亚群的特定标记物，并将其命名为：SOX4+/MAFA+、IL1B+/LYZ+、APOE+/C1QC+。
通过统计分析发现，SOX4+/MAFA+和IL1B+/LYZ+单核细胞/巨噬细胞的比例在炎症性UC和储袋炎患者中显著高于无炎症储袋患者（图2C）。DCs的比例在储袋炎与无炎症储袋样本之间存在明显差异，而APOE+/C1QC+细胞和肥大细胞的比例未见显著差异。值得注意的是，pDCs在无炎症储袋样本中完全缺失（图2C），推测可能是炎症相关的特异性细胞群体，在储袋炎的病理机制中发挥重要作用
SOX4和MAFA被用作标志基因，通过计算机筛选（in silico gating）识别高表达这两个基因的细胞群体（图2D–F），鉴定出IL1RN、LTB等多个促炎基因在储袋炎和炎症性UC样本中显著上调；IL1B+/LYZ+细胞中，IL1B和LYZ基因作为核心标志物（图E），表达与炎症状态密切相关，并伴随多个炎症相关基因（如S100A8、VEGFA）的增加。值得注意的是SPP1（是结直肠癌相关的巨噬细胞标志物）在炎症性UC样本中高表达，但在储袋炎和无炎症储袋样本中无显著差异。此外，APOE+/C1QC+细胞的APOE和C1QC基因高表达表明其可能具有免疫调节功能（图F）。通过拟时序分析（Pseudotime Analysis）研究髓系细胞群体的动态变化及潜在演化轨迹。分析结果显示，IL1B+/LYZ+细胞被鉴定为促炎核心亚群，而SOX4+/MAFA+细胞代表起始状态；APOE+/C1QC+细胞可能作为中间过渡群体，连接促炎和免疫调节状态（图G）。进一步分析表明，IL1B⁺/LYZ⁺细胞的关键标志物LYZ与拟时序显著相关，而FOS和JUN在也与时序相关（图H），但未在APOE+/C1QC+细胞中表达，进一步支持该亚群的过渡性特征。
图2. 炎症组织中髓样细胞群积聚增加
3 T细胞亚群与炎症状态的关系
针对T细胞进行聚类分析，得到12个T细胞簇，并通过差异分析和统计分析（图3A）。发现FOXP3⁺ T细胞，在炎症性UC和储袋炎样本中比例显著增加，而在无炎症储袋样本中的比例较低。有先前的研究表明，FOXP3+ Tregs在炎症样本中也表达TNF，本研究进一步分析发现炎症样本中的FOXP3⁺ Tregs不仅表达TNF，还显著表达BATF，可作为这一亚群的重要特征标志。特异性分析显示，FOXP3⁺/BATF⁺ T细胞在储袋炎和炎症性UC样本中的比例显著增加（图3C）。差异表达分析表明，这些细胞在储袋炎样本中相比UC样本，显著上调了TRBC1、TRBC2、RACK1、ANXA1和CCL5的表达。免疫组织化学实验（HIC）通过检测FOXP3核表达进一步验证了这一发现，与无储袋炎样本相比，储袋炎样本中FOXP3+表达水平有所增加，这与通过 CYTOF 分析在活动性发炎的 UC 患者中发现的Foxp3 +T 细胞增加一致。
在炎症性UC患者样本中，CD8+ T细胞和Naive CD8+ T细胞的比例较低，这种情况与炎症状态无关。而在储袋样本中，无论是否存在炎症状态，CD8+ T细胞的比例始终较高，这可能与回肠固有的免疫特性有关。此外，研究发现CD8+/NR4A2+ T细胞在无炎症的储袋样本中比例显著高于储袋炎和 UC 样本，提示这些细胞可能在维持免疫稳态中发挥重要作用。进一步研究显示，IL2 表达是CD8+和Naive CD8+ T细胞亚群的重要标志基因。通过计算机筛选发现，在储袋样本中，无论是否存在炎症状态，CD8+/IL2+ T细胞的比例显著高于炎症性 UC 样本。同时，基因表达分析表明，储袋样本中（包括无炎症和炎症状态）IL2、CCL4L2、CCL5、TRBC2、XCL2 和 IGKC 的表达显著高于炎症性 UC 样本。这些基因的上调可能与储袋样本中较高比例的CD8+ T细胞密切相关。FOXP3+/BATF+ 细胞是炎症样本中显著扩增的细胞群，显示这些细胞可能在炎症状态下的免疫调控中发挥关键作用，而CD8+细胞在储袋中通常比结肠更丰富，与炎症状态无关。
Tregs可由肠道抗原呈递细胞（如Macrophages和DCs）通过其功能特性诱导或维持。线性回归分析显示，所有三种单核细胞/巨噬细胞亚群（SOX4⁺/MAFA⁺、IL1B⁺/LYZ⁺、APOE⁺/C1QC⁺）均与FOXP3⁺/BATF⁺ T细胞显著相关（图S3D），其中以SOX4⁺/MAFA⁺亚群的相关性最强。在这些SOX4⁺/MAFA⁺单核/巨噬细胞中，通过TREM1和CXCL10等特定分子能诱导FOXP3⁺ Tregs的分化。
图3. 炎症组织中T细胞群失调
4 B细胞亚群在不同疾病类型中的表现相似
虽然B细胞许多样本中占据较高比例，但通过聚类分析只得到5个不同的亚群，包括循环B细胞、滤泡细胞、生发中心细胞以及两种根据NFKBIA表达水平区分的浆细胞（Plasma cells NFKBIA^hi 和 Plasma cells NFKBIA^lo）。通过传统的B细胞marker和差异表达基因（DEGs）对这些亚群进行了精确识别，发现尽管与无炎症储袋样本相比，炎症性UC样本中的浆细胞比例略有增加，但其他B细胞亚群的分布在炎症性UC、储袋炎和无炎症储袋样本中并未显示显著差异，表明B细胞的亚群分布在不同疾病条件中表现出较高的一致性。
图4. 5种主要B细胞群的特征及其在不同样本中的分布分析
5 在公共数据集中验证与炎症相关的免疫细胞
为了验证研究中鉴定的免疫细胞群体，作者整合了Smillie和Martin等人之前发布的关于UC和CD的单细胞数据集，与本研究中的单细胞RNA测序数据进行比较分析。整合后的数据集包含超过35万个免疫细胞，涵盖了主要的免疫细胞类型，包括T细胞、生发中心/滤泡细胞、浆细胞、肥大细胞、髓系细胞，以及Martin等数据集中的一小部分上皮细胞（图4A）。通过比较分析，发现这些细胞类型在不同数据集中具有较高的保守性，进一步支持了本研究结果的可靠性。
FOXP3⁺/BATF⁺ Tregs在三项研究中均被鉴定（图4B），且高表达IL32和IL2RA（图4D）。与非炎症样本相比，FOXP3⁺/BATF⁺ Tregs在UC、CD和储袋炎等炎症性样本中显著增加，表明其在炎症性疾病中的关键作用。固有淋巴细胞（ILCs）在CD样本中显著增加，高表达ID2和CXCL2（图4C），表现出与其他T细胞亚群不同特征（图4D），这种增加独立于炎症状态。IL1B⁺/LYZ⁺炎症性髓系细胞在CD和储袋炎样本中显著增加（图4F–G），但在UC样本中的增加不显著。这些细胞高表达IL8、CCL4等炎症相关基因，且在先前Martin等研究中被标记为“炎症性巨噬细胞”，表达IL1A、CXCL2、CXCL3、IL1B、CCL3等与组织学疾病严重程度相关的OSM特征基因（图4G）。树突状细胞（DCs）仅在CD样本中显著增加（图4F）。同时在储袋炎样本中，其比例也显著高于无炎症储袋样本，其特征基因为CLEC10A和HLA-DRB1（图4G）。这表明DCs在CD和储袋炎中的潜在作用值得进一步研究。SOX4⁺/MAFA⁺单核细胞在储袋炎样本中相比无炎症储袋显著增加，但在UC和CD样本中未观察到显著变化。且这些细胞在CD样本中的检测频率较低，仅占总免疫细胞的不到1%。
根据上述结果，为探究IL1B+/LYZ+和FOXP3+/BATF+细胞与非免疫细胞的相互作用，首先使用线性回归模型：从Smillie的数据集中分析发现，IL1B+/LYZ+细胞与WNT2B+成纤维细胞等6种非免疫细胞具有相关性；FOXP3+/BATF+细胞与14种非免疫细胞显著相关，包括WNT2B+成纤维细胞、炎症成纤维细胞、肠上皮细胞等。进一步进行了IL1B、LYZ、FOXP3和BATF与非免疫细胞的标志基因之间的基因相关性分析（图4H）。发现IL1B+/LYZ+主要与WNT2B+成纤维细胞、毛细血管后静脉及内皮细胞相关。而FOXP3+/BATF+主要与毛细血管后静脉的基因表达显著相关，与其他非免疫细胞标志基因的相关性较少。
图5. 定义与储袋炎、UC和CD活动性炎症相关的细胞状态
6在大规模IPAA患者队列中优先筛选炎症标志物
首先通过对上述12个T细胞，5个B细胞和6个骨髓亚群进行差异分析，得到706个特征基因并构建了免疫细胞特征矩阵（图5A）。此外，作者根据GWAS全基因组关联研究IBD风险基因的表达数据。发现26个IBD风险基因与特定免疫细胞群体显著相关，包括：CD8⁺ T细胞中的IFNG、Th17细胞中的CCL20和IL23R、NK细胞中的IRF8、树突状细胞（DCs）中的HLA-DQB1、滤泡B细胞中的LY9。然而，另有38个IBD相关基因未表现出显著的细胞特异性表达。
在包含250名IPAA患者的研究中，利用706-基因特征矩阵对不同患者亚群进行PCA分析（图5B）。样本包括活动性储袋炎（PI）患者、无储袋炎（NP）患者，以及家族性腺瘤性息肉病（FAP）患者储袋样本（其中包括来自配对活检的 16S rRNA 微生物分析）（FAP 袋很少发生炎症，可作为额外的无炎症对照）。初步分析显示，IPAA患者与FAP患者样本组之间没有明显差异。但当基于综合炎症评分（ISCORE）对样本进行分类后差异明显，其中贡献最大的为ISCORE值最高的患者，表明ISCORE能够更敏感地反映炎症状态，是区分炎症性和无炎症储袋患者的关键指标。因此，作者进一步根据ISCORE值将患者样本分为有炎症（ISCORE >2，n=50）和无炎症（ISCORE <2，n=223）两组，并与未发炎的FAP患者样本进行差异表达分析：炎症性储袋炎样本中，主要差异基因与IL1B⁺/LYZ⁺单核细胞/巨噬细胞相关，包括IL1B、S100A8、IL1RN和CXCL2（图5C）；无炎症FAP储袋样本中，显示出与特定免疫细胞相关的基因增加表达，例如：HLA-DQB1（树突状细胞）；CCL20（Th17细胞）；CD52、BANK1和MS4A1（滤泡细胞）。这些特征表明即使在无活动性炎症的情况下，FAP储袋也可能具有独特的免疫学特性。单独分析IL1B，发现其表达与所有患者的ISCORE显著相关（p<2.2e-16，图5D），进一步确认了IL1B作为炎症标志物的核心作用。
对于16S rRNA微生物测序配对样本，使用微生物群落的操作分类单元（OTU）表对IL1B⁺/LYZ⁺基因特征的sPLS（稀疏偏最小二乘回归分析）分析（图5E），发现IL1B+/LYZ+炎性单核细胞/巨噬细胞群与特定微生物群有关：与梭菌目和拟杆菌目呈正相关，与链球菌属和肠球菌属呈负相关。
图6.鉴定细胞类型特异性转录本并分析IPAA患者得独立数据集
7 UC中的疗法响应和炎症状态
深入研究UC中免疫细胞亚群之间的相互作用及其与治疗响应的关联,作者通过整合免疫细胞特征矩阵和cellPhoneDB数据库，构建了23个免疫细胞亚群之间的受体-配体网络，识别出了856个显著的细胞相互作用（图6A）。发现：
IL1B⁺/LYZ⁺单核/巨噬细胞、DCs和 APOE⁺/C1QC⁺单核/巨噬细胞是在网络中显示出最多的交互对，显示出丰富的受体-配体相互作用，表明这些细胞是炎症反应的核心驱动因子。Th17细胞是另一个重要节点，显著与IL1B⁺/LYZ⁺单核/巨噬细胞、APOE⁺/C1QC⁺单核/巨噬细胞和DCs交互，活跃于趋化因子信号（如CCL3、CCL4、CCL5、HLA-DPB1和CCL20），其受体包括CCR1、CCR4、CCR5、SF13B和CCR6（图6B）。此外，Th17细胞与FOXP3⁺ T细胞通过共刺激分子（如CTLA-4、ICOS、PD-1和CD40）与IL1B⁺/LYZ⁺和APOE⁺/C1QC⁺单核/巨噬细胞群体发生相互作用，提示这些细胞在调控炎症过程中发挥重要作用。上述结果表明IL1B⁺/LYZ⁺单核/巨噬细胞与Th17细胞之间的相互作用可能是UC患者炎症期间免疫反应的重要组成部分
随着针对UC的新型治疗药物的开发，许多药物旨在阻断免疫细胞之间的相互作用。作者进一步评估免疫细胞亚群特异性基因特征是否可以区分治疗响应者和非响应者发现：在 Vedolizumab 的非响应者中，IL1B⁺/LYZ⁺ 单核/巨噬细胞相关基因的高表达表现最为显著，尤其是 IL1B、S100A8 和 S100A9 等促炎因子富集表达。（图6C, D）；且非响应者中约50%的患者表现出IL1B⁺/LYZ⁺单核/巨噬细胞转录因子的高表达，这些促炎细胞可能通过持续分泌促炎因子驱动炎症并导致治疗耐药。与 Vedolizumab 类似，Etrolizumab 的非响应者也表现出 IL1B、IL1RN 和 S100A9 等促炎因子的显著上调，这进一步验证了 IL1B⁺/LYZ⁺ 单核/巨噬细胞在治疗耐药中的重要作用。在 Golimumab 的非响应者中，尽管 IL1B、CXCL2 和 S100A8 等促炎因子的表达略有增加，但与 IL1B⁺/LYZ⁺ 单核/巨噬细胞的关联性较弱。
图7.UC患者对临床治疗的反应和炎症状态
【研究结论】
1、J型储袋中的炎症与UC患者结肠的炎症特征非常相似，均鉴定出了FOXP3+/BATF+ T细胞和三种关键的单核细胞/巨噬细胞亚群（SOX4+/MAFA+、IL1B+/LYZ+、APOE+/C1QC+），表明其可能对相似的治疗方法产生反应；
2、FOXP3⁺/BATF⁺ Tregs是炎症样本中扩增最显著的T细胞亚群，这一亚群可能通过SOX4⁺/MAFA⁺单核/巨噬细胞的作用被诱导或维持；无论是否存在炎症状态，储袋样本中CD8⁺ T细胞的比例始终较高，这可能与回肠固有的免疫特性有关。
3、B细胞亚群分布在储袋炎和UC样本间保持一致，表现出高度的功能保守性；
4、IL1B⁺/LYZ⁺髓系细胞是促炎核心亚群，与炎症状态和特定微生物群落密切相关；
5、溃疡性结肠炎患者对抗整合素生物疗法无反应与IL1B⁺/LYZ⁺髓系细胞相关。
汇报人：吴林雅